Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

CD169-опосредованная торговля ВИЧ-инфекцией в плазменных мембранных инвагинациях в дендритных клетках Аттенуация Эффективность анти-gp120 широко нейтрализующих антител

CD169-Mediated Trafficking of HIV to Plasma Membrane Invaginations in Dendritic Cells Attenuates Efficacy of Anti-gp120 Broadly Neutralizing Antibodies
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4356592/

Я прочитал политику журнала, и авторы этой рукописи имеют следующие конкурирующие интересы: MVG является сотрудником на Bruker Nano Surfaces. Это не меняет нашу приверженность ко всем политикам PLOS по обмену данными и материалами.

Задуманные и разработанные эксперименты: HA SG. Провели эксперименты: HA NGPR MVG. Проанализированы данные: HA MVG. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: HA NGPR MVG. Написал документ: HA SG.

Миелоидные дендритные клетки (DCs) могут захватывать ВИЧ-1 через рецептор CD169 / Siglec-1, который связывается с ганглиозидом GM3 в мембране вирусных частиц. В свою очередь, частицы ВИЧ-1, захваченные CD169, лектин I-типа, экспрессия которого на DCs повышается при созревании с помощью LPS, защищены от деградации в CD169 + содержащих вирусы компартментах (VCC) и распространяются на CD4 + Т-клетки, механизм опосредованной DC-инфекции транс-инфекции ВИЧ-1. В этом исследовании мы описываем механизм формирования VCC и его роль в механизмах иммунизации у ВИЧ-1. Мы обнаружили, что индуцированное ВИЧ-1 образование VCC ограничено миелоидными клетками и что цитоплазматический хвост CD169 является пригодным для торговли и удержания ВИЧ-1 в VCC и последующей транс-инфекции к CD4 + Т-клеткам. Интересно отметить, что введение диароматического эндоцитарного мотива в цитоплазматическом хвосте CD169, что приводит к эндоцитозу частиц ВИЧ-1, подавляет транскрипцию ВИЧ-1, опосредованной CD169. Кроме того, микроскопия с высоким разрешением выявила тесную связь частиц CD169 и HIV-1 в инвагинации поверхностной доступной, но глубокой плазматической мембраны. Интригующе, что частицы ВИЧ-1 в глубоких VCC были неэффективно доступны анти-gp120 широко нейтрализующими антителами, VRC01 и NIH45-46 G54W и, следовательно, были менее восприимчивы к нейтрализации. Наше исследование показывает, что захват ВИЧ-1 CD169 может обеспечить уклонение от вирусов как от врожденного (фагоцитоза), так и от адаптивных иммунных реакций.

Дендритные клетки (DCs) являются профессиональными антигенпредставляющими клетками, и их роль дозорных играет важную роль для выявления мощного противовирусного иммунитета. Тем не менее, ВИЧ-1 использует DC для распространения инфекции несколькими механизмами. Одним из таких механизмов является DC-опосредованный транс-инфекционный путь, посредством которого DC передают захваченный вирус в CD4 + Т-клетки. Недавно мы идентифицировали индуцируемый белок I типа интерферона типа (IFN-I), CD169, в качестве рецептора DC, который опосредует захват ВИЧ-1 и транс-инфекцию. Мы также продемонстрировали обширную совместную локализацию ВИЧ-1 с CD169 в периферических нелизосомных компартментах в DC, хотя механизм и биологическое значение образования купелей остаются неясными. Здесь, в этом исследовании, сообщается, что сопутствующий фактор, связанный с миелоидной клеткой, взаимодействует с CD169 после захвата вируса, приводя к образованию купе. Этот кофактор индуцируется в DCs индуцирующим IFN-I TLR лигандом LPS, но не самим IFN-I. Хотя отсеки, содержащие CD169 + ВИЧ-1, доступны для поверхности, эти отсеки имеют значительную глубину и связаны с поверхностью, так что захваченные вирусные частицы, локализованные в этих уникальных структурах, защищены от обнаружения анти-gp120 широко нейтрализующими антителами. Наше исследование показывает, что взаимодействие CD169-HIV-1 обеспечивает механизм уклонения от деградации фагоцитозом и нейтрализацией антивирусными гуморальными ответами.

Все соответствующие данные содержатся в документе и его файлах вспомогательных данных.

Миелоидные дендритные клетки (DCs) являются профессиональными антигенпредставляющими клетками, которые играют роль дозорного в чувствительных патогенных микроорганизмах и первичном адаптивном иммунитете [1]. ВИЧ, однако, эксплуатирует DC для распространения на CD4 + T-клетки, и, таким образом, было предложено, чтобы DCs играли роль в системном распространении ВИЧ из периферической слизистой оболочки в вторичные лимфоидные ткани [2,3]. В то время как ДЦ инфицированы ВИЧ, а потомки, полученные из поколения в поколение, могут инфицировать CD4 + Т-клетки [4-7], продуктивная инфекция ДК ограничена по нескольким причинам, включая низкую плотность рецептора / корецептора, наличие факторов, связанных с клеточными факторами и врожденные чувствительных механизмов, вызывающих антивирусные иммунные ответы, такие как секреция интерферона I типа [8-11]. В отличие от этого, DC могут захватывать частицы ВИЧ-1 и передавать захваченный вирус в CD4 + Т-клетки без установления продуктивной инфекции в DC через плотное соединение «клетка-клетка», называемое вирусологическим синапсом [12], механизм DC-опосредованной передачи ВИЧ-1 -инфекция, которая, возможно, эволюционировала, чтобы обходить DC-внутренние антивирусные ответы.

Недавно наша группа и другие идентифицировали CD169, также известный как Siglec-1, в качестве преобладающего рецептора для зрелого DC-опосредованного захвата ВИЧ-1 и последующей передачи вируса в Т-клетки [13,14]. CD169, трансмембранный белок типа I, является самым большим членом сиаликоново-связывающего иммуноглобулин-подобного лектина (Siglec), содержащего 17 внеклеточных повторов иммуноглобулиноподобного домена, включая N-концевой домен V-набора, который распознает α2-3 связанные сиаловые кислотные остатки, один трансмембранный домен и короткий цитоплазматический хвост (КТ) [15]. При связывании ВИЧ-1 с CD169 у зрелых DCs частицы ВИЧ-1 накапливаются в CD81 тетрасапина + компартментами [13,14]. Однако эти отсеки только слабо или плохо окрашиваются маркерами эндосомы / лизосомы, такими как CD63 и Lamp1 [16,17]. Независимо от того, связаны ли эти отсеки ВИЧ-1 + с поверхностью клетки, предметом интенсивных дебатов [см. [18]). В то время как ранние исследования показали, что эндоцитоз частиц ВИЧ-1 важен для эффективной транс-инфекции Т-клеток [19-21], последние исследования, однако, вызвали эти данные и поставили под вопрос, что поверхностные связанные частицы ВИЧ-1, присутствующие в инвагинации плазматических мембран были основным источником вирусов, способствующих эффективной DC-опосредованной транс-инфекции ВИЧ-1 Т-клеток [22,23]. Интересно, что КТ человеческого CD169 содержит 44 аминокислоты, и нет определенных сигнальных мотивов или сайтов фосфорилирования, которые могли бы способствовать потенциальному заражению и интернализации вирусных частиц при связывании лиганда. Поэтому, как скопированные CD169 частицы ВИЧ-1 накапливаются, а вирусная инфекция, сохраняющаяся в этих отсеках, остается неясной.

В этом исследовании мы изучили роль CD169 в торговле ВИЧ-1 у зрелых ДК и облегчили транс-инфекцию Т-клеток ВИЧ-1. Мы обнаружили, что CD169-опосредованный перенос ВИЧ-1 на инвагинации неэндоцитарной плазматической мембраны специфичен для клеточного типа, и что транс-инфекция может быть достигнута даже в отсутствие КТ. Транс-инфекционная эффективность коррелировала со способностью CD169 удерживать частицы ВИЧ-1 на поверхности клетки. Интересно отметить, что однократное замещение аминокислоты (Ala to Tyr в положении 1683) в CT CD169 приводило к эндоцитозу ВИЧ-1, связанного с CD169, и мутантный CD169 не мог поддерживать транс-инфекцию Т-клеток, что указывало на сохранение поверхности посредством CD169 имеет решающее значение для ВИЧ-1, чтобы получить доступ к транс-инфекционному пути. Кроме того, с использованием микроскопии с высоким разрешением мы обнаружили, что частицы CD169 и HIV-1 были тесно связаны с LPS-созревшими DC в отсеках на периферии клеток, приблизительно от 800 нм до 1 мкм в глубину от поверхности клетки. Эти инвазивные инфекции периферических вирусов, содержащих плазматические мембраны, не наблюдались в DC, вызванных воздействием только IFN-α, что указывает на необходимость сопутствующего фактора LPS-индуцибельного хозяина для формирования инвагинаций плазматической мембраны CD169 + HIV-1. Интригующе, что частицы ВИЧ-1, локализованные в инвагинациях плазматических мембран в LPS-зрелых DC, были неэффективно доступны и, следовательно, менее восприимчивы к α-gp120 широко нейтрализующим антителам по сравнению с вирусами, свободными от клеток. Таким образом, наше исследование показывает, что опосредованный CD169 захват и торговля ВИЧ-1 внутри DC может не только обеспечить уклонение от вируса от эндоцитарных механизмов, которые могут привести к деградации вирусных частиц в лизосомальных отделениях, но также защитить HIV-1 от нейтрализующих антител через образование вирус-содержащих поверхностно-подверженных плазматических мембранных инвагинаций в LPS-созрел DC.

Предыдущие исследования показали, что при захвате вируса зрелыми ДК частицы ВИЧ-1 накапливаются в отсеках на периферии клеток [23,24]. Кроме того, образование конъюгатов DC-T клеток приводит к поляризованному высвобождению захваченных вирусных частиц в сторону Т-клеток для установления оптимальной инфекции CD4 + T-клеток [25]. Недавно мы, как и другие, сообщили, что частицы ВИЧ-1 в этих отсеках сильно колокализуются с CD169 [13,14]. Поскольку CD169 также был локализован с ВИЧ-1 в вирусологическом синапсе DC-T-клеток [13,14], мы хотели определить механизм, посредством которого CD169 опосредует трафик ВИЧ-1-частиц в зрелых DC.

Во-первых, мы стремились установить клеточную линию, которая могла бы повторить образование периферических вируссодержащих компартментов (VCC), которые наблюдаются при захвате ВИЧ-1 CD169 в зрелых DCs [13,14]. CD169 стабильно трансдуцировали в моноцитарную клеточную линию THP-1, линию клеток Raji B и клетки HeLa. Экспрессия CD169 на клеточной поверхности была протестирована с помощью проточной цитометрии и оказалась сопоставимой или большей, чем у зрелых DC (S1, рис. A). Кроме того, индуцированная экспрессия CD169 на первичных клетках (лечение ЛПС ДК, зрелые DC) или сконструированная экспрессия CD169 на клеточных линиях (THP-1, Raji или HeLa) приводила к резкому увеличению захвата вируса (фиг.1А). Затем мы исследовали, удалось ли какой-либо из клеточных линий повторить формирование CD169 + VCC, обнаруженных в зрелом DC. Зрелые DC, клетки THP-1 / CD169, Raji / CD169 и HeLa / CD169 инкубировали с VLP Gag-mCherry HIV и окрашивали для общего CD169 после мембранной пермеабилизации с TritonX-100 (+ Tx100) или без мембранной пермеабилизации для визуализации поверхности CD169 поверхности (Поверхность) (фиг.1В). Во всех тестированных клетках VLP были сильно колокализованы CD169 при окрашивании после мембранной пермеабилизации, как сообщалось ранее [14]. В зрелых DCs VLP часто находили внутри отсеков на периферии клеток, некоторые из которых были окрашены CD169 без мембранной пермеабилизации (фиг.1B). В клетках THP-1 / CD169 VLPs были сильно колокализованы с CD169 в компартментах, подобных тем, которые были обнаружены у зрелых DC (фиг.1B). Интересно отметить, что, подобно зрелым DC, клетки CD169 + VLP + в клетках THP-1 / CD169 также были частично доступны для поверхностных анти-CD169-антител. В то время как VLP, захваченные клетками Raji / CD169, были сильно колокализованы CD169, VLP оставались на поверхности в отсутствие образования VCC. Напротив, захваченные VLP были обнаружены во внутриклеточных клетках CD169 + в клетках HeLa / CD169, поскольку антитело против CD169 не могло окрашивать VCC без мембранной проницаемости (фиг.1B).

(A) Клетки, инкубированные с частицами ВИЧ-1, лизировали, и клеточные лизаты использовали для измерения клеточного p24gag. Показанные данные представляют собой средний процент захваченного p24gag (вирус) ± SEM независимых экспериментов, выполненных в трех повторах (n = 3 для DC, n = 5 для THP-1, n = 3 для Raji и HeLa). (B) CD169, экспрессирующие клеточные линии и зрелые DC, инкубировали с VLP Gag-mCherry и окрашивали для плазменной мембраны CD169 (поверхность, верхняя панель) или всего CD169 (+ Tx100, нижняя панель). CD169 (зеленый), VLP Gag-mCherry (красный) и ядро ​​(синий). Показаны репрезентативные декорированные изображения одиночных срезов ячеек. Шкала шкалы составляет 5 мкм. (C) Клетки, инкубированные с частицами ВИЧ-1, были совместно культивированы с CD4 + Т-клетками для мониторинга транс-инфекции ВИЧ-1. Клетки лизировали через два дня после начала совместной культивирования и лизатов, используемых для измерения активности люциферазы. Значения были нормированы на активность люциферазы, наблюдаемую в контрольных клетках (незрелые DC или CD169low / null контрольные клеточные линии). Представленные данные представляют собой средства ± SEM независимых экспериментов, выполненных в трех повторах с CD4 + Т-клетками от разных доноров (n = 3 для DC, n = 4 для THP-1, n = 3 для Raji и n = 4 для HeLa).

Затем мы определили, может ли дифференциальная локализация частиц ВИЧ-1 при захвате CD169 в клеточных линиях влиять на опосредованную CD169 транс-инфекцию. Хотя частицы ВИЧ-1, захваченные зрелыми ДК, клетки ТНР-1 / CD169 или клетки Raji / CD169 были переданы в CD4 + Т-клетки, что привело к устойчивой инфекции Т-клеток (фиг.1С, транс-инфекция была увеличена более чем в 10 раз в клетках CD169 + по сравнению с CD169 незрелыми DC-последовательностями или пустым переносимым вектором клеткам контрольных клеток), клетки HeLa / CD169 не смогли передать ВИЧ-1 в Т-клетки (фиг.1С). Эти данные свидетельствуют о том, что сохранение вируса ВИЧ-1 на поверхности клетки после опосредованного CD169 захвата (фиг.1В) необходимо для доступа вируса к пути транс-инфекции. Следствием этих находок является то, что эндоцитозированные частицы ВИЧ-1 некомпетентны для транс-инфекции, опосредованной CD169.

CD169 сообщается как фагоцитарный рецептор на макрофагах свиней, который может опосредовать эндоцитоз PRSSV [26]. Однако до настоящего времени в CT CD169 человека не были описаны ранее определенные сигнальные мотивы эндоцитоза. Поскольку CD169 был продан и коллацинизирован с ВИЧ-1 в поверхностных отсеках в миелоидных клетках (фиг.1), мы предположили, что в КТ был обнаружен неопознанный мотив торговли, который способствовал колокализации CD169 и ВИЧ-1 в VCC. Были сконструированы два мутантных мутанта CD169 CT (фиг.2A), один из которых имеет стоп-кодон сразу после трансмембранного домена CD169 (CD169ΔCT) [15]. Поскольку в предыдущих исследованиях было продемонстрировано значительное снижение экспрессии целевых белков плазматической мембраны клеточной поверхности при делеции цитоплазматических хвостов [27, 28], мы построили второй мутант CT169 CT, который экспрессировал первые четыре аминокислоты CT (CD169ΔCT4R). Эти мутанты CD169 CT трансдуцировали в клетки THP-1, и способность этих стабильно трансдуцированных клеточных линий, экспрессирующих CD169-мутантов для захвата ВИЧ и образования VCC, сравнивалась с таковой, наблюдаемой с клетками THP-1, экспрессирующими CD169 дикого типа (THP-1 / CD169) (Фиг.1В). Удаление цитоплазматического хвоста (CD169ΔCT) приводило к уменьшению экспрессии CD169 в клетках THP-1 (фиг.2B и S1, рис. B). Кроме того, клеточная поверхностная экспрессия CD169ΔCT была дополнительно уменьшена (рис. 2C и D) и привела к сильному ослаблению захвата ВИЧ-1 (рис. 2E). Интересно отметить, что включение проксимальных 4-аргининовых остатков мембран в цитоплазматическом хвосте приводило к более высокой экспрессии CD169 в клетках и частичному спасению экспрессии CD169 на поверхности клеток (фиг.2C, 2D и S1 Fig B) и, что важно, 1 (рис. 2Е). Эффективность захвата вируса клетками THP-1 / CD169ΔCT4R была значительно ниже, чем у клеток THP-1 / CD169 (рис. 2E), в соотношении с уровнем экспрессии CD169 на поверхности клетки (фиг.2C и D). Следующие со-культивированные CD4 + Т-клетки с клетками THP-1, экспрессирующие CD169 CT-мутанты, исследуют роль CD169 CT в опосредовании транс-инфекции ВИЧ-1. Интересно, что клетки THP-1 / CD169ΔCT4R, но не THP-1 / CD169ΔCT, могли передавать ВИЧ-1 в CD4 + Т-клетки (фиг.2F). Кроме того, не было существенной разницы в эффективности транс-инфекции (Т-клеточная инфекция на количество вируса, захваченного клетками THP-1), опосредованного клетками THP-1 / CD169 и THP-1 / CD169ΔCT4R (фиг.2G). Наконец, CD169 + VCCs наблюдались также в клетках THP-1 / CD169ΔCT4R (фиг.2Н), что указывает на то, что последовательности CD169 CT после четырех остатков аргинина были пригодны для образования VCC и CD169-опосредованной транс-инфекции ВИЧ-1.

(A) Последовательности дикого типа и мутантных CD169 CT. Звездочки представляют собой стоп-кодоны, введенные в ORF двух CT-мутантов. (B) Вестерн-блот-анализ лизатов клеток THP-1, экспрессирующих дикого типа или мутантного CD169. (C) Экспрессию клеточной поверхности CD169 на клетках THP-1 измеряли с помощью проточной цитометрии. (D) Относительная экспрессия клеточной поверхности мутантов CT169 CT была количественно определена и нормализована к таковой, наблюдаемой с клетками THP-1 / CD169. (E) Клетки подвергали иммунизации ВИЧ-1, измеряли промытый и связанный с клетками p24gag. Приведенные данные представляют собой захват вируса мутантами CTP-1 / CD169 CT (ΔCT или ΔCT4R), нормированными на то, что наблюдается с клетками THP-1 / CD169. (F) Трансфекцию, опосредованную мутантом ТГР-1 / CD169 или ТГР-1 / CD169, определяли путем измерения активности люциферазы в со-культурах ТНР-CD4 + Т-клеток через 2 дня после начала совместной культуры. Показанные данные представляют собой относительную передачу вируса мутантами CTP-1 / CD169 CT (ΔCT или ΔCT4R), которые наблюдаются с клетками THP-1 / CD169. (G) Эффективность транс-инфекции была рассчитана как транс-инфекция (активность люциферазы) на количество захваченного вируса (связанный с клеткой p24gag) и нормализованный к таковому, наблюдаемый с клетками THP-1 / CD169 (установленный как 100). Представленные данные представляют собой средства ± SEM трех (D — F) или четырех (G) независимых экспериментов. (H) клетки THP-1 / CD169 или THP-1 / CD169 & Delta; CT4R инкубировали с VLP Gag-mCherry (красный), промывали, фиксировали и окрашивали для CD169 (зеленый) и ядра (синий). Показаны репрезентативные декорированные изображения одиночных срезов ячеек. Шкала шкалы представляет собой 5 мкм. WT: THP-1 / CD169, ΔCT: THP-1 / CD169ΔCT, ΔCT4R: THP-1 / CD169ΔCT4R и Vec: пустой вектор, трансдуцированный THP-1.

Являются ли эндоцитозные частицы ВИЧ-1 в ДК по-прежнему компетентными для транс-инфекции, были предметом значительных дебатов [6,13,16,18,21-24,29]. Поскольку последовательности ТТ оказались непригодными для опосредованной CD169 трансфекции, а частицы ВИЧ-1, захваченные CD169, оставались в доступных VCC с поверхностью (рис.2), мы предположили, что ВИЧ-1 эксплуатирует зараженный CD169 трафик, чтобы уклониться от фагоцитарных ответов хозяев, которые нацелены на захваченные патогенных микроорганизмов к деградирующим отделениям. Чтобы проверить эту гипотезу, мы ввели единую точечную мутацию в CT CD169, которая вводит ди-ароматический мотив (от Ala to Tyr в положении 1683), такой как тот, который известен как существенный для опосредованного маннозой рецептора фагоцитоза бактериальных патогенов, несущих терминально-маннозилированные белков в их клеточной стенке [30,31] (фиг.3А). Этот мутант CD169, обозначенный как CD169YF, конститутивно экспрессируется в клетках THP-1 через ретровирусную трансдукцию. Экспрессия CD169YF была подтверждена как вестерн-блоттингом (фиг.3B), так и проточной цитометрией (фиг.3C и S1 Рис. B) и была выражена с аналогичными уровнями на поверхности клетки как CD169 дикого типа (рис. 3D). Интересно, что кинетика интернализации анти-CD169-антител усиливалась в ТНР-1 / CD169YF по сравнению с клетками THP-1, экспрессирующими CD169 дикого типа, что указывает на то, что однократное замещение аминокислоты функционирует как мотив сигнала интернализации (S2 Fig A).

(А) Показаны аминокислотные последовательности ТТ дикого типа (WT) CD169 и мутантного CD169YF. Мутация аланина до тирозина в положении 1683 (красным) создает ди-ароматический мотив, YF (подчеркнутый). (B) Вестерн-блот-анализ для экспрессии CD169 в лизатах клеток THP-1 / CD169 и THP-1 / CD169YF. (C) Репрезентативный FACS-анализ экспрессии CD169 на поверхности клеток дикого типа и YF-мутанта, экспрессирующих клетки THP-1. (D). Средняя интенсивность флуоресценции клеточной поверхности CD169 на YF-мутанте, экспрессирующем клетки THP-1, была количественно определена и нормализована к таковой, наблюдаемой с клетками THP-1 / CD169 (wt) (установлена ​​на уровне 100). (E) клетки инкубировали с VLP Gag-mCherry и окрашивали для CD81, CD63 или Lamp1 и ядра. CD81, CD63 или Lamp1 (зеленый), VLP Gag-mCherry (красный) и ядро ​​(синий). Показаны репрезентативные декорированные изображения одиночных срезов ячеек. Шкала шкалы представляет собой 5 мкм. (F) Сопоставление между зелеными (CD81, CD63 или Lamp1) и красными (VLP) сигналами сообщается как средний коэффициент Пирсона ± SEM. Каждая точка представляет собой одну ячейку. Двухсторонние значения P рассчитывались с использованием непарного t-теста в GraphPad Prism 5. ***: P <0.0001. (G) Клетки подвергали тестированию с помощью HIV-1, измеряли промытый и связанный клетками p24gag. Захват вируса, наблюдаемый с клетками THP-1 / CD169YF, был нормализован по сравнению с клетками THP-1 / CD169 (WT, установленный как 100). (H) Клетки, зараженные ВИЧ-1 / Bal-luc, промывали, совместно культивировали с CD4 + Т-клетками и лизировали в течение двух дней после начала совместной культуры для измерения активности люциферазы. Уровень передачи вируса, наблюдаемый в соматических культурах ТНР-1 / CD169 (мас.) -CD4 + Т-клеток, был установлен как 100. (I) Эффективность транс-инфекции рассчитывали как транс-инфекцию (активность люциферазы) на захват вируса (клетка -связанный p24gag) и показан относительно наблюдаемого с клетками THP-1 / CD169 (установлено как 100). Показанные данные представляют собой средства ± SEM из четырех (D) или шести (от G до I) независимых экспериментов.

Затем мы исследовали локализацию VLP Gag-mCherry HIV при захвате клетками THP-1 / CD169YF. Оба белка CD169 и CD169YF, экспрессирующие клетки THP-1, подвергали тестированию с помощью VLP и окрашивали для CD81, белка тетраспанина, который колокализуется с ВИЧ-1 в VCC в зрелых DCs [16,17] или CD63 и Lamp1 (маркеры позднего эндосомального отделения). В клетках THP-1 / CD169 VLP были колокализованы CD81, но не с CD63 или Lamp1 (фиг.3E), что согласуется с предыдущими сообщениями о локализации ВИЧ-1 в зрелых DC [16,17,23,24]. Напротив, колокализация VLP Gag-mCherry HIV в клетках THP-1 / CD169YF была уменьшена в CD81 + отделениях, но улучшена в отделениях CD63 + или Lamp1 + (фиг.3Е). Кроме того, VCC в THP-1 / CD169YF были неэффективно доступны поверхностно-прикладными антителами (S2 Fig B и C), что указывает на то, что CD169YF интернализовали VLPs в поздние эндосомы или лизосомы. Эти различия во внутриклеточной локализации VLP Gag-mCherry HIV между клетками THP-1 / CD169 и THP-1 / CD169YF были статистически значимыми (фиг.3F и S2 Fig B). В то время как клетки THP-1 / CD169YF улавливали частицы ВИЧ-1 так же эффективно, как клетки THP-1 / CD169 (рис. 3G), транс-инфекция ВИЧ-1 CD4 + T-клеток клетками THP-1 / CD169YF была полностью аннулирована (рис. 3H и I). В совокупности эти результаты показывают, что эндоцитозные частицы ВИЧ-1 некомпетентны для доступа к CD169-зависимому пути транс-инфекции ВИЧ-1.

Затем мы попытались более подробно описать архитектуру CD169 + VCC в зрелых DC. Экспрессия CD169 в DCs индуцируется при лечении лигандами TLR, такими как LPS и polyI: C [14]. В отличие от TLR, воздействие IFN-α, которое приводит к частичному созреванию DCs [32,33], также может усилить экспрессию CD169 [14], хотя предполагаемые различия в фенотипах созревания, индуцированных IFN-α и TLR, могут привести к различным изменениям в торговле вирусом созревших DCs [34]. Таким образом, DCs, дифференцированно созревшие с LPS или IFN-α (называемые LPS-DC или IFN-α-DC, соответственно), были использованы для определения локализации ВИЧ-1 в фенотипически расходящихся CD169-экспрессирующих первичных клетках. В то время как CD169 был сильно усилен как на LPS-DC, так и на IFN-α-DC (фиг.4A), IFN-α-DC демонстрировали фенотип частичного созревания, выражающий низкие уровни активирующих антигенов, CD86 и HLA-DR в соответствии с ранее опубликованными результатами [32,33]. Захват ВИЧ-1 как LPS-DC, так и IFN-α-DC и последующая транс-инфекция CD4 + T-клеток были аналогичным образом увеличены по сравнению с наблюдаемыми с незрелыми DC (фиг.4B и C).

(A) Репрезентативный анализ FACS для экспрессии CD169 на LPS или IFN-α-созрел DC. (B) Захват ВИЧ-1 незрелыми (NT), IFN-α или LPS-созревшими DCs определяли путем измерения связанного с клеткой p24gag в клеточных лизатах. (C) Перенос ВИЧ-1 в CD4 + Т-клетки с помощью незрелых (NT), IFN-α или LPS-созревших DC определяли путем измерения активности люциферазы в DC-CD4 + Т-клеточных со культурах. Эксперименты по захвату и переносу ВИЧ-1 выполнялись в трех повторах с DC, выделенных из восьми независимых доноров. Отдельная точка представляет собой один донор, а средства ± SEM изображены. (D) LPS или IFN-α-зрелые DC были инкубированы с флуоресцентными частицами ВИЧ-1 (зеленые) и окрашивались для CD169 (красный) и ядра (синий). Показаны репрезентативные декорированные изображения одиночных срезов ячеек. Шкала шкалы представляет собой 5 мкм. (E) Типичные электронные микрофотографии LPS или IFN-α-созревших DC, инкубированных с ВИЧ-1. Нижние панели представляют собой изображения с более высоким увеличением области, изображенной в выделенных квадратах в верхних панелях. Стрелки указывают на частицы вируса. Шкала шкалы представляет собой 1 мкм для верхних панелей и 500 нм для нижних панелей. (F) Клетки инкубировали с ВИЧ-1 и окрашивали для HIV-1 p24gag (зеленый) и CD169 (красный). Клетки визуализировали с помощью суперразрешающей микроскопии FPALM. Верхние панели представляют собой единый LPS или IFN-α созревший DC, в то время как средние панели показывают поперечные сечения вдоль линии a-b, указанной в верхних панелях. Нижние панели — это изображения, увеличенные из области, изображенной в выделенных (пунктирных) квадратах в средних панелях. Шкалы шкалы составляют 1 мкм в верхней и средней панелях и 500 нм в нижних панелях. LPS: обработанные LPS DC, IFN-α: обработанные IFN-α DC, незрелые: незрелые DC.

Затем мы исследовали природу CD169 + VCC, образованных в IFN-α-DC и LPS-DC, с помощью обычной деконволюционной микроскопии, электронной микроскопии и микроскопии с высоким разрешением. В то время как частицы ВИЧ-1 были сильно колокализованы с CD169 на периферии клеток в обоих типах клеток, содержащие вирусы карманные компартменты были обнаружены только в LPS-DC, но не в IFN-α-DC (фиг.4D). Электронная микроскопия также показала вирусосодержащие карманные отсеки в ЛПС-DC, как сообщалось ранее (фиг.4Е, S3, рис. А-С и [19,20]). Напротив, большая часть частиц ВИЧ-1 находилась на поверхности в ИФН-α-DC (рис.4E и S3 Рис. D-F) в долинах между дендритными расширениями или присутствовала в структурах, предположительно образованных при коллапсе дендритов в IFN- α -DCs (фиг.4E и S3 — от D до F). Эта расходящаяся локализация ВИЧ-1 в ИФН-α- и ЛПС-DC была дополнительно исследована с помощью суперразрешающей микроскопии. Мы использовали флуоресцентную фотоактивационную локализационную микроскопию (FPALM) с методом двухплоскостной захвата [35-37], которая позволила нам визуализировать CD169 + VCC в зрелых DC с разрешением 20-40 нм (X-Y) и 50-80 нм (Z). В соответствии с традиционной деконволюционной и электронной микроскопией (фиг.4D и E) ВИЧ-1 и CD169 накапливались в карманных отсеках в ЛПС-DC, тогда как ВИЧ-1 был обнаружен в основном на клеточном краю в ИФН-α-DC (Рис. 4F, верхние панели, S4 Рис. D — F и S1). Сосредоточив внимание на поперечном сечении этих клеток (вдоль линии между а и b в верхних панелях), глубина отсеков, содержащих частицы ВИЧ-1 в ЛПС-DC, была измерена при 800 нм-1 мкм (фиг.4F, средняя панели). Напротив, частицы ВИЧ-1 (p24gag) и CD169 сгруппированы в длинную «долин-подобную» структуру, которая оказалась на поверхности IFN-α-DC (фиг.4F, средние панели). В обоих типах клеток молекулы p24gag (зеленый) были тесно связаны с CD169 (красный) (рис.4F, нижние панели, S4 Fig и S2 Movie и S3 Movie), что подразумевает важную роль CD169 в формировании VCC в DC. В совокупности эти результаты предполагали, что обработка ЛПС и ИФН-α ДК приводила к расходящимся CDCC9 + VCC и что для образования CD49 + ВИЧ-1, содержащих карманоподобные структуры в DC, необходим фактор, индуцированный LPS.

Затем мы попытались определить, попадают ли частицы ВИЧ-1 в CD169 + VCC в ЛПС-DC и IFN-α-DC в внеклеточную среду. Неинфицированные или зараженные вирусом CD169 + LPS-DC подвергались обширному протеолитическому перевариванию либо трипсином, либо проназой (фиг.5А). Экспрессия CD169 на клеточной поверхности и количество частиц ВИЧ-1, которые оставались связанными с LPS-DC и IFN-α-DC, после обработки протеазой определяли соответственно FACS и ELISA p24gag (фиг.5A). В отсутствие связывания ВИЧ-1 CD169 в основном присутствовал на поверхности LPS-DC и IFN-α-DC и оставался чувствительным к расщеплению проназой, но не трипсином (фиг.5B и C, отсутствие вируса), что указывает на то, что внеклеточный домен CD169 не содержит последовательностей распознавания трипсина. Интересно отметить, что когда клетки, содержащие ВИЧ-1, были сформированы перед обработкой проназой, CD169 по-прежнему чувствителен к проназе-перевариванию (фиг.5С, + вирус). Затем мы исследовали, были ли частицы ВИЧ-1, связанные с CD169, в LPS-DC и IFN-α-DC, чувствительны к перевариванию протеазы. LPS-DC- или IFN-α-DC-ассоциированные частицы ВИЧ-1 нечувствительны к воздействию трипсина (фиг.5D), что согласуется с выводами о том, что CD169 устойчиво к трипсину (фиг.5В и С) и CD169-ВИЧ-1 является белковым (CD169) -липидным (GM3) взаимодействием [13,14,38,39]. Напротив, в соответствии с способностью проназы эффективно расщеплять CD169 на клеточной поверхности (фиг.5B), обработка проназы уменьшала содержание ВИЧ-1, связанного с LPS-DC- или IFN-α-DC, на ~ 60% (фиг.5D ), предполагая, что VCC были доступны для поверхностно-прикладной проназы. Проназ-резистентная клетка-ассоциированная фракция ВИЧ-1 может быть отнесена к тем вирусным частицам, которые либо остаются связанными с остаточным CD169 (~ 20% молекул CD169 оставались связанными с клетками даже после проназы, фиг.5C), либо p24gag in цитоплазму после слияния вируса со зрелыми ДК. Все вместе, эти результаты свидетельствуют о том, что большинство CD169 + VCC в LPS-DC и IFN-α-DC остаются доступными с поверхности клетки и, таким образом, чувствительны к поверхностному усвоению пронации.

(A). Экспериментальная процедура, используемая для тестирования восприимчивости частиц ВИЧ-1, захваченных CD169, к обработке внеклеточной протеазой. (B) Репрезентативный FACS-анализ экспрессии CD169 клеточной поверхности на LPS-DC. (C) Относительную экспрессию клеточной поверхности экспрессии CD169 измеряли с помощью проточной цитометрии и нормировали на то, что наблюдалось при необработанном контроле (NT, установленном на 1). Представленные данные представляют собой средства ± SD из пяти (LPS-DC, Trp), девять (LPS-DCs, Prn) и два независимых (IFN-DCs, Typ и Prn) независимых экспериментов с DC из разных доноров. (D) LPS или IFN-α-зрелые DC, инкубированные с ВИЧ-1, обрабатывали проназой или трипсином. Количество вирусных частиц, оставшихся в клетках после обработки протеазами, определяли путем измерения связанного с клеткой p24gag, и значения были нормализованы до уровня, наблюдаемого с необработанными клетками (NT). Представленные данные представляют собой средства ± SD из четырех (LPS-DCs, Trp), семь (LPS-DCs, Prn) и два независимых (IFN-DCs, Typ и Prn) независимых экспериментов с DC из разных доноров. (C и D) Двухсторонние значения P были рассчитаны с использованием одного образца t-теста в GraphPad Prism 5. *: P <0,05, ***: P <0,0001. Trp: образец, обработанный трипсином, Prn: проназа-обработанный образец.

Затем мы попытались определить, доступны ли связанные с CD169 частицы ВИЧ-1 в CD169 + VCC в LPS-DC или IFN-α-DC для поверхностно-примененных крупных молекулярных зондов, таких как анти-gp120 широко нейтрализующие антитела (bNAbs) или анти- CD169. LPS-DC или IFN-α-DC были пульсированы флуоресцентными частицами Lai-iGFP ВИЧ-1 и окрашены либо для HIV-1 gp120, либо для CD169 перед фиксацией и проницаемостью, так что антигены, доступные для поверхностно-прикладных антител, будут визуализироваться только. Для сравнения, окрашивание для общего HIV-1 gp120 или CD169 проводилось параллельно после фиксации и проницаемости (+ Tx100). Большинство частиц ВИЧ-1 и CD169 в ИФН-α-DC были обнаружены на поверхности клетки и могут быть визуализированы с помощью поверхностно-применяемых анти-gp120 (фиг.6А) или антител против CD169 (фиг.6В). Чтобы количественно оценить доступность захваченных частиц ВИЧ-1 к поверхностно-применяемым антителам, фракцию флуоресцирующих частиц ВИЧ-1, перекрывающихся с окрашиванием антителами, рассчитывали с использованием коэффициентов Мандера. Количественная оценка не выявила существенных различий между окрашиванием поверхности и полной молекулярной окраской как для HIV-1 gp120, так и для CD169 в IFN-α-DC (фиг.6C и D). Хотя некоторые из VCC Lai-iGFP + в LPS-DC были окрашены поверхностными анти-gp120 или анти-CD169 антителами (фиг.6A и B), некоторые из вирусных частиц, присутствующих на «дне» карманного структуры (наконечники стрел, фиг.6А и В, ЛПС) были недоступны как для анти-gp120, так и для анти-CD169-антитела, что указывает на то, что CD169 + VCC в LPS-DC были либо закрытыми, либо недоступными для поверхностного применения зондами из-за стерических помех. Кроме того, мы наблюдали статистически значимые различия в коэффициентах Мандерса среди клеток (LPS-DC), окрашенных двумя различными методами окрашивания (рис. 6C и D).

(A и B) LPS или IFN-α-созревшие DC, инкубированные с флуоресцентными частицами ВИЧ-1, окрашивались как для поверхностных gp120 (A), так и для CD169 (B) на живых клетках (поверхности, верхние панели) или общего gp120 ( A) или CD169 (B) на клетках после фиксации и терапии TritonX-100 (+ Tx100, нижние панели). ВИЧ-1 (зеленый), gp120 или CD169 (красный) и ядро ​​(синий). В наконечниках стрелок указываются зеленые частицы ВИЧ-1 в VCC, которые не были окрашены поверхностно-применяемыми антителами. Показаны репрезентативные декорированные изображения одиночных срезов ячеек. Шкала шкалы представляет собой 5 мкм. (C и D). Совместная локализация между частицами ВИЧ-1 и gp120 (C) или CD169 (D) сообщается как коэффициенты Мандерса. Каждая точка представляет собой одиночную ячейку, и показаны средства ± SEM. Представленные данные представляют собой репрезентативный эксперимент с использованием DCs, выделенных из двух разных доноров. (E и F) ВИЧ-1, подвергнутые воздействию LPS или IFN-α-созревших DC или бесклеточных (CF) ВИЧ-1 частиц, инкубировали с возрастающими концентрациями VRC01 (E), NIH45-46 G54W (F) или sCD4-183 (G) до начала инфицирования CD4 + T-клеток. Ось x показывает концентрацию входных VRC01 (E), NIH45-46 G54W (F) и sCD4-183 (G) в log мкг / мл, а ось y показывает процентное ингибирование относительно инфекции без какого-либо антитела. Приведенные данные представляют собой средства ± SEM типичного эксперимента, выполненного в трех повторениях. (H, I и J) значения IC50 для VRC01 (H), NIH45-46 G54W (I) или sCD4-183 (J) показаны как среднее ± SEM, и каждая точка представляет данные, полученные из клеток, полученных от независимого донора. Два хвостовых значения P рассчитывали с использованием непарного (C и D) или парного (H, I и J) t-теста в GraphPad Prism 5. * P <0,05, **: P <0,01, ***: P <0,0001 , ns: не имеет значения.

Различия в поверхностной доступности антител к CD169 + VCC между LPS-DC и IFN-α-DC побудили нас предположить, что частицы ВИЧ-1, локализованные в VCC в LPS-DC, могут оставаться компетентными для зрелой DC-опосредованной трансинфекции даже в наличие анти-gp120 bNAbs. Чтобы проверить эту гипотезу, анализы нейтрализации проводили с использованием анти-gp120 bNAbs (VRC01 и NIH45-46 G54W) и двухдоменного sCD4 (sCD4-183). Либо связанный с LPS-DC-, либо IFN-α-DC-ВИЧ-1 инкубировали с увеличением концентрации VRC01, NIH45-46 G54W или sCD4-183 до совместной культивирования с CD4 + Т-клетками. Параллельно, бесклеточная ВИЧ-1-инфекция CD4 + T-клеток проводилась в присутствии или отсутствии VRC01, NIH45-46 G54W или sCD4. В то время как VRC01 и NIH45-46 G54W эффективно ингибировали CCR5-тропический ВИЧ-1 (псевдотипированный с Bal Env) инфекцией CD4 + Т-клеток [IC50 (VRC01) = 0,035 ± 0,005 мкг / мл (фиг.6E и H), IC50 ( NIH45-46 G54W) = 0,012 ± 0,004 мкг / мл (фиг.6F и I)], перенос LPS-DC-ассоциированных частиц ВИЧ-1 был неэффективно нейтрализован [IC50 (VRC01) = 1,152 ± 0,308 мкг / мл (фиг. 6E и H) и IC50 (NIH45-46 G54W) = 0,223 ± 0,062 мкг / мл (фиг.6F и I)]. Интересно, что перенос частиц ВИЧ-1 из IFN-α-DC в Т-клетки был более восприимчивым к нейтрализации с помощью VRC01 и NIH45-46 G54W [IC50 = 0,508 ± 0,155 мкг / мл (фиг.6E и H) и 0,069 ± 0,016 мкг / мл (фиг.6F и I) соответственно], чем при опосредованном LPS-DC, хотя эффективность опосредованного IFN-α-DC переноса в присутствии VRC01 и NIH45-46 G54W была все еще выше, чем у клеток без клеток инфекции Т-клеток.

В противоположность этому, sCD4-183, малый gp120-нейтрализующий реагент (26kD) способен одинаково ингибировать все три способа заражения, а именно бесклеточную, опосредованную IFN-α-DC и опосредованную LPS-DC-инфекцию ВИЧ-1 CD4 + Т-клеток (фиг.6G). Значения IC50 для бесклеточной, IFN-α-DC или LPS-DC-ассоциированной ВИЧ-1 инфекции CD4 + Т-клеток составляли 0,171 ± 0,047, 0,307 ± 0,039 и 0,467 ± 0,117 мкг / мл соответственно (фиг.6J). Эти результаты показывают, что связь ВИЧ-1 с CD169 в VCC в зрелых DCs защищает вирусы от обнаружения анти-gp120 bNAbs и может обеспечить уклонение вируса от адаптивных иммунных ответов in vivo.

В этом исследовании мы описали CD169 + VCCs в зрелых DC и обнаружили, что захваченные частицы ВИЧ-1 в LPS-созревших DC были локализованы в инвазиях на поверхностной связанной плазматической мембране на глубинах ~ 800 нм-1 мкм (фиг.4). Мы выдвигаем гипотезу о том, что многовалентная связь частиц CD169 и ВИЧ-1 или кластеризация нескольких молекул CD169 (индуцированная связыванием вирусных частиц) может усилить локализованную концентрацию рецептор-лигандных комплексов, которые сохраняются на поверхности клеток из-за неспособности CD169 опосредовать эндоцитоз , Привлечение LPS-индуцированного миелоидного клеточного сопутствующего фактора (ов) при захвате вируса к локализованному мембранному микродомену может наложить дополнительную деформацию и стресс на мембрану, которая освобождается от образования мембранных инвагинаций (фиг.7), хотя механизмы которые препятствуют закрытию мембраны и образованию эндосомы, еще предстоит идентифицировать. Интересно отметить, что локализация ВИЧ-1 в VCC в LPS-созревших DC уменьшала доступность вирусных частиц против gp120 bNAb, VRC01 и, следовательно, уменьшала эффективность нейтрализации анти-gp120 bNAbs, VRC01 и NIH45-46 G54W (рис. 6). Локализация ВИЧ-1 и CD169 в решетчатой ​​структуре в VCC может обеспечить стерическое затруднение только для крупных молекул, таких как нейтрализующие антитела. Частицы ВИЧ-1, захваченные ВИЧ-1, ассоциированные с IFN-α-DC, также были менее восприимчивыми к VRC01 и NIH45-46 G54W по сравнению с бесклеточным ВИЧ-1, хотя локализация частиц ВИЧ-1 в ИФН-α-DC была в которые не имели сопоставимой глубины, чем наблюдаемые в LPS-DC (рис.4), по-видимому, из-за отсутствия набора кофактора (-ов) в IFN-α-DC, необходимых для формирования инвагинации мембран. Поскольку частицы ВИЧ-1 были обнаружены на дне дендритов и / или окружены дендритами (фиг.4Е), образующими кластеры CD169 и ВИЧ-1 в «долинподобной» структуре (фиг.4F), эта уникальная локализация ВИЧ -1 в ИФН-DC могут также препятствовать доступу VRC01 и NIH45-46 G54W к ВИЧ-1.

Захват частиц ВИЧ-1 с помощью CD169 приводит к образованию CDCC9 + VCC в LPS-зрелых DC. Боковое перемещение мембраны CD169-связанного ВИЧ-1 может привести к накоплению частиц ВИЧ-1 в микродоменах плазматических мембран в ЛПС-ДК. Многовалентные взаимодействия между множественными частицами CD169 и ВИЧ-1 и кофактором (факторами) могут вызвать локализованные стресс и деформацию, на которые реагирует плазматическая мембрана, формируя инвагинации. Стрелка указывает на боковое перемещение CD169-связанных частиц ВИЧ-1 в VCC.

Острая инфекция ВИЧ-1 in vivo индуцирует различные провоспалительные цитокины, включая интерферон типа I [40]. Такие воспалительные состояния могут дифференцировать моноциты в месте заражения в воспалительные РС [41-43]. Ранее сообщалось, что воспалительные DC, генерируемые in vitro, являются CD169 + и эффективно распространяют ВИЧ-1 на Т-клетки [14]. В то время как триггер типа I IFN-ответы индуцируют экспрессию количества генов, стимулированных интерферонами, некоторые из которых являются антивирусными и ограничивают репликацию вируса, индукция CD169 может компенсировать ISG-опосредованные ограничения на репликацию вируса в периферической слизистой оболочке. Таким образом, в острой фазе инфекции индуцированный IFN CD169 на воспалительных DC может поддержать установление инфекции в слизистых CD4 + Т-клетках. В дополнение к IFN, предыдущие исследования продемонстрировали увеличение уровней LPS в сыворотке крови в течение инфекции ВИЧ-1, в первую очередь из-за скомпрометированной целостности кишечного эпителия [44]. Связанная с слизистой оболочкой-транслокация LPS может привести к системной активации DC и усилению CD169, который не только увеличивает распространение вируса на CD4 + Т-клетки, но также может обеспечить уклонение от гуморальных реакций, которые развиваются, но не нейтрализуют передачу клеток в клетку в тканях слизистой оболочки. В настоящее время большое количество усилий поддерживает дизайн вирусных векторных иммунопрофилактических схем, которые экспрессируют b-блоки против gp120 для индукции защиты in vivo [45,46]. Поскольку DC-опосредованная транс-инфекция CD4 + T-клеток была предложена в качестве важного пути распространения ВИЧ-1 in vivo [2,3], для повышения нейтрализации IFN-α-DC или in vivo может потребоваться значительное увеличение титров антител LPS-DC-опосредованное распространение ВИЧ-1.

CD169 экспрессируется исключительно на миелоидных клетках in vivo [15,47], и интересно образование CD169 + VCC при захвате ВИЧ-1 было репродуцировано только в DC и THP-1 моноцитоидной клеточной линии, но не в клетках Raji B или HeLa, конститутивно экспрессирующих CD169 (фиг.1В). Хотя частица ВИЧ-1, связанная с CD169, оставалась на поверхности клеток в клетках Raji / CD169, вирусные частицы накапливались во внутриклеточных, недоступных по поверхности отсеках в клетках HeLa / CD169. Эти результаты свидетельствуют о том, что для образования поверхностно связанных VCC может потребоваться кофактор, специфичный для миелоидных клеток. Интересно отметить, что последовательности CT CD169 оказались непригодными для образования VCC, поскольку усечение CT после четырех мембранно-проксимальных аргининовых остатков (THP-1 / CD169ΔCT4R) сохраняло экспрессию клеточной поверхности CD169 и, что важно, приводило к образованию VCC в клетках THP-1 после Захват ВИЧ-1 (рис.2). Предыдущие результаты из нашей лаборатории и другие также продемонстрировали, что захват ВИЧ-1 DCs также снижается при лечении β-метилциклодекстрином, реагентом для секвестрации холестерина [17, 48]. Поскольку образование VCC происходило даже в отсутствие КТ, возможно, что боковая ассоциация и кластеризация CD169 обусловлена ​​взаимодействием трансмембранного домена CD169 с белковой и / или липидной молекулой в таких микродоменах с богатой холестерином мембраной. Следует отметить, что экспрессия такого кофактора регулируется стимуляцией ЛПС ДК, но не при лечении только ИФН-α (фиг.4D). Будущие исследования потребуются для определения характера этого сопутствующего фактора миелоидных клеток путем сравнения зависимых от TLR4 (TRIF или зависимых от MyD88) и IFNAR-опосредованных (зависимых от JAK-STAT) сигнальных путей в миелоидных клетках.

CD169 представляет собой рецептор распознавания образов, который захватывает разнообразные бактериальные и вирусные патогены, распознавая α2,3-сиалилированные гликоконъюгаты на поверхности патогена [47]. В дополнение к ВИЧ-1 захват других зараженных вирусов, таких как вирус мышиного лейкоза, вирусы нипах и хендра геморрагической лихорадки CD169, также зависит от связывания α2,3-сиалилированных GSL, включенных в мембраны вирусных частиц [14,49]. Хотя некоторые исследования включали CD169 в качестве эндоцитарного рецептора, который опосредует интернализацию патогенов в ранние эндосомы [26], CD169, в отличие от других членов семейства белков Сиглека, CD169 не имеет определенных эндоцитарных мотивов в своем CT [15,47]. Кроме того, исследования, описанные в этом отчете, показывают, что частицы ВИЧ-1, захваченные CD169, не нацелены на эндоцитоз, а скорее сохраняются на поверхности миелоидной клетки в инвагинациях плазматических мембран. Интересно, что экзогенное введение ди-ароматического эндоцитарного мотива в КТ CD169 приводило к интернализации ВИЧ-1 и резкому ослаблению транс-инфекции, опосредованной CD169 ВИЧ-1 (фиг.3). В совокупности эти результаты в значительной степени указывают на необходимость удержания ВИЧ-1 на клеточной поверхности для доступа к зрелой линии передачи инфекции, опосредованной DC / CD169.

Мы выдвигаем гипотезу, что эта уникальная схема торговли людьми выгодна для ВИЧ-1, поскольку она обеспечивает удаление вирусных частиц из эндоцитарных путей в ДК, что может привести к деградации вирионов и / или представлению антигена Т-клеткам, чтобы вызвать устойчивые адаптивные иммунные ответы [50]. Интересно предположить, что ВИЧ-1, возможно, эволюционировал, чтобы собираться и выходить из микродоменов, обогащенных GM3, с помощью микродоменов [49], так что GM3-зависимые взаимодействия ВИЧ-1 с CD169 обеспечивают связывание вируса как из миелоидных клеточных иммунных фагоцитарных механизмов деградации вируса и зависимого от антитела обнаружения и нейтрализации вирусной инфекционности. Кроме того, поскольку DC были предложены, чтобы быть первыми клетками, которые столкнулись с частицами ВИЧ-1 в слизистой оболочке половых органов [2], местное введение таких реагентов может предотвратить половую передачу ВИЧ-1. Поэтому развитие агентов, которые нацелены на ВИЧ-1- Взаимодействие CD169 может быть привлекательным потенциальным антивирусным терапевтическим средством для сокращения пандемии ВИЧ-1.

Это исследование было установлено, что оно освобождено от участия в Институциональном комитете по обзору Медицинского центра Бостонского университета, поскольку оно не соответствует определению исследований человеческих предметов, поскольку все образцы людей были собраны анонимным способом и не было получено никакой идентифицируемой личной информации.

Человеческий CD169 клонировали в ретровирусный вектор экспрессии, LNCX (LNC-CD169) и был описан ранее [14]. Усечения в цитоплазматическом хвосте человеческого CD169 вводили ПЦР с использованием следующих наборов праймеров: для CD169 / ΔCT, CD169-4188-sense (ATCAGGGACAGGCCATGTCC) и CD169-ΔCT-антисмыслового (TTTTTATCGATCACCAGGTGTAGCAGGCCC CCAGG); для CD169 / ΔCT4R, CD169-4188 и CD169-ΔCT4R антисмысловой (TTTTTATCGATTAACGCCTCCTTCTCCAGGTGTAGCAGGC). Точечную мутацию в цитоплазматическом хвосте CD169 (A1683Y) вводили на сайт-направленный мутагенез на основе ПЦР (QuikChange, Agilent Technologies) с использованием следующих праймеров: CD169-YF-sense (CGAGAATTCGGTGGAGATGTATTTTCAGAAAGAGACCACGC) и CD169-YF-антисмысловой (GCGTGGTCTCTTCTCGAAAATACATCTCCACCGAATTCTCG). Фрагмент SbfI-ClaI, содержащий усечения или мутации в CT CD169, был заменен на соответствующую часть LNC-CD169. Все клоны были проверены путем секвенирования. Стабильная экспрессия мутантов CT169 CT в линии моноцитарных клеток THP-1, клеточной линии HeLa и линии клеток Raji B была выполнена путем трансдукции с помощью псевдотипированных ретровирусных векторов мутанта LNC-CD169 VSV-G с последующим выбором G418, как описано ранее [14]. CD169-положительные клетки дополнительно очищали либо MACS (Miltenyi Biotec), либо FACS (BD AriaIII). Экспрессия белка подтверждали вестерн-блот-анализом и проточной цитометрией (BD Calibur), как описано ниже.

Экспрессионная плазмида pGag-EGFP, которая экспрессирует слитый белок Gag-eGFP ВИЧ-1, была получена из программы NIAID Reference Reference and Reagent. ВИЧ-1 Gag-mCherry экспрессионная плазмида, которая экспрессирует красный флуоресцентный слитый белок Gag-mCherry, была описана ранее [24]. ВИЧ-1 LaiΔenv-luc (Env дефицитный ВИЧ-1 Lai, содержащий ген репортера люциферазы вместо nef orf), Lai / Balenv-luc (CCR5-тропическая инфекционная провирусная конструкция, кодирующая люциферазу) и CCR5-тропическая инфекционная провирусная плазмида Lai / YU-2env были описаны ранее [51-53]. Lai-imCherry, провирусная конструкция, продуцирующая красные флуоресцирующие инфекционные вирусные частицы, была получена из Lai-iGFP [14] путем замены фрагмента, кодирующего GFP, на фрагмент mcherry. Вектор экспрессии CCR5-тропного ВИЧ gp160 (Bal env) был получен из вектора экспрессии CXCR4-тропного HIV gp160 (Lai env) [54] путем замены всего гена en en Lai соответствующей областью Bal env.

Дендритные клетки человека (ДК) были получены из моноцитов периферической крови CD14 +, как описано ранее [14]. DCs созревали с помощью сверхчистого E. coli K12 LPS (100 нг / мл, Invivogen) или IFN-α (1000 U / ml, PBL Interferon Source) в течение 2 дней до использования в анализах. Первичные человеческие CD4 + Т-клетки были положительно выделены из CD14-истощенных РВМС, используя конъюгированные с CD4 магнитные гранулы и LS MACS ячейки разделения клеток (Miltenyi Biotech). Положительно изолированные CD4 + Т-клетки активировали 2% PHA (Invitrogen) в течение 2 дней, промывали и культивировали в IL-2 (50 ед. / Мл), содержащем RPMI, дополненную 10% FBS. HEK293T (линия клеток эпителиальных почек человека), Raji (линия клеток человека человека, полученная из NIH программы исследований и справочной реактивов против СПИДа), THP-1 (линия моноцитарных клеток человека, клон АТСС, полученная из NIH программы исследований и справочной реактивов СПИДа ), а клетки HeLa были описаны ранее [39]. Репликативные компетентные вирусы, Lai / Balenv-luc, Lai / YU-2env и Lai-imCherry, были получены из клеток HEK293T с помощью трансфекции фосфатом кальция, как описано ранее [54]. Флуоресцентные вирусные частицы, полученные из вируса Gag, генерировались с помощью транзиторных трансфекций клеток HEK293T с плазмидами экспрессии Gag-eGFP или HIV Gag-mCherry. Протеины ВИЧ-1, псевдотипированные с Bal Env, были получены из клеток HEK293T посредством совместной трансфекции ВИЧ-1 LaiΔenv-luc с плазмидой экспрессии Bal-1 Bal-1. Вирусы или VLP-содержащие клеточные супернатанты собирали через 2 дня после трансфекции, очищали от клеточного мусора центрифугированием (300 x g, 5 мин), пропускали через фильтры 0,45 мкм и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования. Для некоторых экспериментов вирусы в супернатантах концентрировали ультрацентрифугированием на 20% сахарозной подушке [24 000 об / мин и 4 ° С в течение 2 часов с ротором SW32Ti (Beckman Coulter)]. Гранулы вируса ресуспендировали в PBS, аликвотировали и хранили при -80 ° C. Содержание капсида инфекционных частиц ВИЧ-1 или VLP определяли с помощью ELISA p24gag [54]. VSV-G псевдотипированные ретровирусные векторы мутанта LNC-CD169 были получены, как описано в другом месте [14].

Зрелые DC (1×105, см. Выше), клетки THP-1 (1×105), клетки Raji (1×105) или HeLa (5×104) инкубировали с вирусом (10-20 нг p24gag) в течение 2 часов при 37 o C в полных средах RPMI , промывали 4 раза PBS и анализировали на захват с использованием либо p24gag ELISA. Улавливание вируса определяли количественно путем измерения p24gag, связанного с лизированными клетками, с использованием собственного ELISA p24gag, описанного ранее [54]. Для переноса инфекционных вирусов Lai / Balenv-luc, 1×105 зрелых DC, клеток THP-1, клеток Raji или 5×104 клеток HeLa инкубировали с вирусом (10-20 нг p24gag) в течение 2 часов при 37 ° C в полных средах RPMI, промывали 4 раза PBS и совместно культивировали с аутологичными или гетерологичными CD4 + Т-клетками при соотношении клеток 1: 1 или 1: 2 в полных средах RPMI с IL-2. Клетки лизировали через 48 часов после инфицирования, а активность люциферазы в клеточных лизатах измеряли с использованием Bright-Glo (Promega). Все анализы проводили с клетками, полученными из минимум трех независимых доноров, и каждый эксперимент выполняли в трех повторностях.

Для оценки экспрессии мутантов CD169 CT в клетках THP-1 клеточные лизаты разрешали с помощью SDS-PAGE и переносили на PVDF-мембраны. Мембраны зондировали с помощью мышиного анти-CD169-антитела (7D2, Novus Biologicals) или анти-актинового антитела кролика (SIGMA). Для измерения экспрессии CD169 на клеточной поверхности клетки окрашивали конъюгированным с Alexa488 мышиным анти-CD169 (AbD Serotec) и анализировали с помощью FACS Calibur (BD), как описано в поддерживающих методах (см. S1 Text).

Чтобы определить степень воздействия на клеточную поверхность связанных с CD169 частиц ВИЧ-1 на зрелой поверхности постоянного тока, клетки, инкубированные в присутствии или в отсутствие 10 нг (p24gag) ВИЧ-1 в течение 2 часов, интенсивно промывали холодным PBS и охлаждали при 4 ° С в течение 30 мин перед инкубацией с проназой (4 мг / мл, в Ca2 +, содержащей PBS, Roche) в течение 30 мин при 4 ° С. Альтернативно, инфицированные вирусом клетки инкубировали с 0,25% трипсином (Invitrogen) в течение 5 мин при 37 ° С. После обработки клетки интенсивно промывали холодным PBS. Количество связанных с клетками частиц ВИЧ-1 измеряли с помощью p24 ELISA (описано выше) и экспрессию CD169 измеряли с помощью FACS, как описано выше. Значения были нормализованы до значений необработанных образцов.

Для исследования чувствительности DC-ассоциированных нейтрализующих реагентов HIV-1 к gp120, VRC01, NIH45-46 G54W и sCD4-183 (полученных из NIH AIDS Reagent Program), 5×104 зрелых DC были инкубированы с HIV-1 Bal Env псевдотипированными LaiΔenv (10 нг p24gag) в течение 2 часов при 37 ° C, промывали 4 раза PBS и охлаждали при 4 ° C в течение 15 мин. Серийно разведенный VRC01, NIH45-46 G54W или sCD4-183, начинающийся с 10 или 20 мкг / мл в конечной, добавляли к импульсным DC-клеткам HIV-1 или вирусу без клеток (50 нг p24gag) и инкубировали в течение 1 часа при 4 ° C. Клетки дважды промывали холодным PBS, а аутологичные или гетерологичные CD4 + Т-клетки добавляли при соотношении 1: 2 для контроля транс-инфекции CD4 + Т-клеток, как описано выше. Клеточный свободный ВИЧ-1 добавляли непосредственно к CD4 + Т-клеткам. Эти эксперименты проводили в трех повторах с DC из по меньшей мере девяти независимых доноров. Бесклеточные инфекции CD4 + Т-клеток выполняли с клетками, полученными из по меньшей мере пяти независимых доноров в трех повторах. Нелинейная регрессия использовалась для оценки установленной кривой, а значения IC50 были рассчитаны в GraphPad Prism 5.

Чтобы исследовать структуру клеток, содержащих CD169 +, содержащих HIV-1, в DCs, использовалось суперрезонансное FPALM (флуоресцентная фотоактивированная локализационная микроскопия). LPS- или IFN-α-стимулированные DC (1×106 клетки) инкубировали с 2,5 мкг p24gag Lai / YU-2env в течение 2 часов при 37 ° C и интенсивно промывали для удаления несвязанных вирусов. Клетки фиксировали 4% PFA, пермеабилизировали, блокировали нормальной ослиной сывороткой и окрашивали для ВИЧ-1 моноклональным антителом против p24 мыши (AG3.0, полученным из NIH-программы для реактивов против СПИДа) с последующим вторичным ослиным антимышиным IgG -Cy3B. Клетки блокировали 20% нормальной сывороткой мыши, и экспрессию CD169 визуализировали с помощью конъюгированного с Alexa647 mAb против CD169 (AbD Serotec). Клетки прикрепляли к покровному траву и подвергали микроскопическому анализу. Изображения были записаны с помощью микроскопа сверхвысокого разрешения Vutara 200 (Bruker Nano Surfaces, Солт-Лейк-Сити, UT) на основе подхода Biplane FPALM [36]. Образцы были отображены с использованием возбуждающих лазеров на 647 нм и 488 нм соответственно и 405 нм активационного лазера в буфере для фотосъемки, включающем 20 мМ цистеамина, 1% бетамеркаптоэтанола и поглотителей кислорода (глюкозооксидазу и каталазу) в 50 мМ Трис-буфере при рН 8,0. Изображения записывались с использованием объектива для погружения воды 60x / 1,2 NA Olympus и Photometrics Evolve 512 EMCCD с коэффициентом усиления 50, частотой кадров 50 Гц и максимальными мощностями 647 нм, 488 нм и 405 лазерами, установленными в 8, 10 и 0,05 кВт / см2 соответственно. Данные были проанализированы программным обеспечением Vutara SRX (версия 4.09). Вкратце, частицы были идентифицированы по их яркости из комбинированных изображений, взятых в обеих плоскостях и двух цветовых каналах одновременно. Если частица была идентифицирована в нескольких последующих кадрах камеры, данные из этих кадров были объединены для конкретных идентифицированных частиц. Затем идентифицированные частицы были локализованы в трех измерениях путем подбора необработанных данных в настраиваемой области, представляющей интерес (обычно 16х16 пикселей), центрированной вокруг каждой частицы в каждой плоскости с помощью трехмерной модели, которая была получена из записанных наборов данных борта. Четыре записанных поля были выровнены автоматически, вычисляя аффинное преобразование между каждой парой плоскостей. Смещение образца было скорректировано путем взаимной корреляции определенных локализованных частиц [55] или отслеживания фидуциарных маркеров. Соответствующие результаты были сохранены в виде списков данных для дальнейшего анализа.

Структура отделений ВИЧ-1, содержащих CD169 + в DC, визуализировалась с помощью электронной микроскопии. 4,5 x106 стимулированных LPS- или IFN-α-DC-инкубированных с 9 мкг p24gag Lai / YU-2env в течение 2 часов при 37 ° C и интенсивно промывали для удаления несвязанных вирусов. Клетки фиксировали 4% PFA и 1% глутаральдегидом в 0,1 М буфере PHEM (60 мМ ТРУБЫ, 25 мМ HEPES, 2 мМ MgCl2 и 10 мМ EGTA). Клетки дополнительно фиксировали 2% -ным тетроксидом осмия, дегидратировали в этаноле и внедряли в эпоксидную смолу, как сообщалось ранее [29]. Сверхтонкие срезы (60-80 нм) внедренных клеток окрашивали 3% уранилацетатом и 1% свинцовым цитратом и подвергали визуализации с помощью электронного микроскопа Philips CM-12 при 100 кВ.

Чтобы определить, остались ли VLP-содержащие компартменты связанными с клеточной поверхностью, клетки HeLa / CD169 (высевают на покровные стекла на 24-луночной планшете для культуры тканей накануне), клетки THP-1 / CD169, клетки Raji / CD169 или зрелые DC ( 2×105 клеток) инкубировали с 10 нг p24gag VLP Gag-mCherry в течение 2 часов при 37 ° C, интенсивно промывали для удаления несвязанных VLP, охлаждали до 4 ° C и окрашивали антителом против CD169 мыши, конъюгированным с Alexa488 (AbD Serotec) на лед в течение 1 часа, до фиксации с 4% PFA. Для общего окрашивания CD169 клетки, облученные вирусом, фиксировали, пермеабилизировали и окрашивали конъюгированным с Alexa488 мышиным анти-CD169 в течение 1 часа при комнатной температуре. Для определения внутриклеточной локализации VLP клетки THP-1 / CD169 (2×105) инкубировали с 10 нг p24gag Gag-mCherry VLP в течение 2 часов при 37 ° С, промывали и фиксировали 4% PFA. Вирусодержащие отсеки визуализировали путем окрашивания античеловеческим CD81 (BD), анти-человеческим CD63 (Santa Cruz) или античеловеческим Lamp1 (Santa Cruz) при 10 мкг / мл с последующим вторичным конъюгированным с Alexa594 козьим антимышиным IgG (Invitrogen) при 10 мкг / мл. Чтобы визуализировать отсеки, содержащие ВИЧ-1 в DC, стимулированные LPS- или IFN-α-DC (4 × 105 клеток) инкубировали с 1 мкг Lai-iGFP в течение 2 часов при 37 ° C и интенсивно промывали для удаления несвязанных вирусов. Для окрашивания поверхностных ВИЧ-1 частиц или CD169 клетки охлаждали и окрашивали антителом против gp120 (VRC01) или mAb против CD169 (7D2, Novus Biologicals) соответственно, при 10 мкг / мл на льду в течение 1 часа , до фиксации с 4% PFA. Альтернативно, клетки, облученные вирусом, фиксировали 4% PFA, проницаемым TritonX-100 и затем окрашивали антителом против gp120 (VRC01) или анти-CD169 mAb (7D2, Novus Biologicals). Затем клетки окрашивали антителом против IgA, связанным с Alexa594, для визуализации окрашивания gp120, Invitrogen или IgA594-конъюгированного козьего антимышиного IgG (для окрашивания CD169, Invitrogen). Ядерное окрашивание визуализировалось с помощью DAPI (Sigma), и клетки были установлены на стеклянном слайде с Fluoromount G (Southern Biotech). Изображения были получены с использованием микроскопа Olympus IX70, оборудованного для деконволюции DeltaVision (Applied Precision). Изображения были деконвертированы с использованием программного обеспечения SoftWoRx (Applied Precision), обработано с помощью ImageJ и pseudocolored для представления данных. Для исследования колокализации на клетках THP-1 были получены изображения по меньшей мере для 20 клеток, деконволюции, сглаживания для максимальной интенсивности, чтобы избежать смещения выбора, присущего анализу изображений одиночной фокальной плоскости, и проанализированы для коэффициента корреляции Пирсона (R) с ImageJ. Для количественной оценки доступности антител к ВИЧ-1-частицам в CD169 + VCC в дифференцированных стимуляторах зрелых DC, изображения были получены на 10-15 клетках, деконволюционированы и сплющены для максимальной интенсивности. Для специфической количественной оценки фракции флуоресцентной частицы ВИЧ-1, перекрывающейся с сигналами антител (получение красного (антитела) на зеленом (ВИЧ-1)), коэффициенты Мандерса рассчитывались с использованием ImageJ. Пороги устанавливались как среднее ± стандартное отклонение интенсивности на каждом канале.

(A) Представлен репрезентативный FACS-анализ экспрессии клеток CD169 на незрелых и зрелых DC, родительских (векторных) или CD169-трансдуцированных клеточных линиях. (B) Репрезентативный FACS-анализ поверхности клетки и общей (поверхностной и внутриклеточной) экспрессии CD169 на дикий тип и CT-мутант, экспрессирующий клетки THP-1.

(EPS)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(A) ТГР-1 клетки, экспрессирующие CD169YF дикого типа (WT) CD169 или CT, CD169YF инкубировали с насыщающими количествами (10 мкг / мл) антитела против CD169 человека или соответствующими контрольными изотипами в течение 30 минут при 4 ° C. Клетки промывали дважды при 4 ° С и затем аликвоту (1 × 105 клеток) удаляли и помещали на лед (точка времени 0 мин). Оставшиеся клетки затем смещали до 37 ° С в течение 30 минут для стимуляции эндоцитоза. Чтобы остановить интернализацию, клетки переносили до 4 ° С, а количество молекул CD169, связанных с антителом, оставалось на поверхности, выявленное окрашиванием антителом против конъюгированного с ПЭ конъюгированным козьим антителом против IgG мыши и анализом с помощью проточной цитометрии. Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) изотипических контролей была вычтена в каждый момент времени, а МФИ через 30 мин были нормализованы до уровня, наблюдаемого через 0 мин. Показанные данные представляют собой процент анти-CD169-антитела, оставшегося на поверхности клетки через 30 минут после инкубации при 37 ° C, и представляет собой среднее ± SEM четырех независимых экспериментов. (B) Клетки инкубировали с VLP Gag-mCherry и окрашивали для плазменной мембраны CD169 (поверхность, верхняя панель) или всего CD169 (+ Tx100, нижняя панель). CD169 (зеленый), VLP Gag-mCherry (красный) и ядро ​​(синий). Показаны репрезентативные декорированные изображения одиночных срезов ячеек. Шкала шкалы составляет 5 мкм. (C) Соосаждение между зелеными (CD169) и красными (VLP) сигналами сообщается как средний коэффициент Пирсона ± SEM. Каждая точка представляет собой одну ячейку. Два хвостовых значения P рассчитывали с использованием непарного t-теста в GraphPad Prism 5. *: P <0,05, **: P <0,01.

(EPS)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Показаны изображения с высоким увеличением, представляющие VCC в LPS-созревших DC (от A до C) и IFN-α-созревших DC (D-F), и стрелки указывают на вирусные частицы. Шкала шкалы представляет собой 500 нм. LPS: LPS-зрелые DC, IFN-α: IFN-α-зрелые DC.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(От A до C) LPS-зрелые DC или (D-F) IFN-α-зрелые DC были инкубированы с HIV-1 и окрашивались для HIV-1 p24gag (зеленый) и CD169 (красный). Большие изображения представляют собой единый LPS или IFN-α созревший DC, в то время как вставки показывают изображения, увеличенные из области, изображенной в выделенных (пунктирных) квадратах в панелях. Шкалы шкалы составляют 1 мкм на больших панелях и 500 нм в вставках. LPS: LPS-зрелые DC, IFN-α: IFN-α-зрелые DC.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

IFN-α-DC инкубировали с ВИЧ-1 и окрашивали для HIV-1 p24gag (зеленый) и CD169 (красный). Изображения клеток Z-стека были получены с помощью сверхрефлекторной микроскопии FPALM, и трехмерная структура была восстановлена ​​вычислительно. Фильм представляет собой боковой вид одной ячейки, показывающей кластеры ВИЧ-1-CD169 вдоль поверхности клетки.

(МЫ)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

LPS-DC инкубировали с ВИЧ-1 и окрашивали для HIV-1 p24gag (зеленый) и CD169 (красный). Изображения клеток Z-стека были получены с помощью сверхрефлекторной микроскопии FPALM, и трехмерная структура была восстановлена ​​вычислительно. Фильм представляет собой боковой вид CD169 + VCC, показанный на рисунке 4F (LPS, внизу).

(МЫ)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

IFN-α-DC инкубировали с ВИЧ-1 и окрашивали для HIV-1 p24gag (зеленый) и CD169 (красный). Изображения клеток Z-стека были получены с помощью сверхрефлекторной микроскопии FPALM, и трехмерная структура была восстановлена ​​вычислительно. Фильм представляет собой боковой вид кластера CD169-HIV-1 в «долинной» структуре, изображенной на фиг.4F (IFN-α, внизу).

(МЫ)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Следующие реагенты были получены в рамках программы NIH AIDS Reagent, отдела СПИДа, NIAID, NIH: THP-1ATCC и Raji от Dr. Li Wu и Vineet N. KewalRamani, иммуноглобулин ВИЧ-1 от NABI и Национального института сердца и крови (доктор Луис Барбоса), pGag-EGFP от д-ра Мэрилин Реш, гибридома HIV-1 p24gag (183-H12-5C) из Dr. Bruce Chesebro, Моноклональное антитело к ВИЧ-1 p24 (AG3.0) от доктора Джонатана Аллана, HIV-1 gp120 MAb (VRC01) от доктора Джона Маскола, HIV MAb NIH45-46 G54W IgG от доктора Памелы Бьоркман и sCD4-183 от Pharmacia, Inc. Мы благодарим базовую установку проточной цитометрии BUMC, г-н Дон Ганц (Отдел физиологии и биофизики, BUSM) и Гарвардскую медицинскую школу по электронной микроскопии для оказания технической помощи.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *