Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Пассивная передача умеренных титров мощных и широко нейтрализующих анти-ВИЧ моноклональных антител блокирует инфекцию SHIV у макак

Passive transfer of modest titers of potent and broadly neutralizing anti-HIV monoclonal antibodies block SHIV infection in macaques
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4172223/

G.J. В настоящее время Набель является Санофи, Кембридж, MA 02139.

Пять мощных и широко анти-ВИЧ-нейтрализующих моноклональных антител способны блокировать инфекцию двумя разными SHIV у обезьян. Авторы показывают, что антитела, нацеленные на внешний слой гликана, являются наиболее эффективными и определяют, что титры примерно 1: 100 защищают половину животных.

Широко признано, что эффективные человеческие вакцины, направленные против вирусных патогенов, вызывают нейтрализующие антитела (NAbs). Пассивная передача NAbs против ВИЧ-1, обеспечивающая стерилизующую иммунитет к макакам, была использована для определения титров нейтрализации плазмы, которые должны присутствовать во время воздействия, чтобы предотвратить заражение вирусами SIV / HIV химерного вируса (SHIV). Мы вводили пять недавно изолированных мощных и широко действующих анти-ВИЧ-нейтрализующих моноклональных антител (mAbs) к макакам резуса и вызывали их внутриректально через 24 часа с двумя разными R5-тропическими SHIV. Объединив результаты, полученные от 60 оспоренных животных, мы определили, что титр защитной нейтрализации в плазме, предотвращающий вирусную инфекцию у 50% облученных обезьян, был относительно скромным (~ 1: 100) и потенциально достижимым путем вакцинации.

Важнейшей проблемой в исследованиях в области ВИЧ с начала эпидемии СПИДа более 30 лет назад стала разработка эффективной профилактической вакцины. Наиболее эффективные профилактические вакцины, направленные против патогенов человека, вызывают нейтрализующие антитела (NAbs, Amanna and Slifka, 2011). Исторически моноклональные и поликлональные NAbs пассивно вводились восприимчивым людям и животным для предотвращения вирусного заболевания (Keller and Stiehm, 2000; Buchwald and Pirofski, 2003). Однако, поскольку инфекции ВИЧ-1, как только они были установлены, почти всегда приводят к смертельным исходам, эффективные пассивно передаваемые антитела должны блокировать обнаружение вируса для предотвращения заболевания. Пассивная передача ранних поколений mAb против ВИЧ-1 продемонстрировала, что они могут обеспечить стерилизационную защиту в макаках против проблем с SHIV (Mascola et al., 1999; Baba et al., 2000; Parren et al., 2001). Однако количество антител, необходимых для предотвращения заражения вирусом, было настолько высоким, что считалось, что этот тип защиты не был достигнут путем вакцинации.

В течение последних четырех-пяти лет из ВИЧ-1-инфицированных людей были выделены новое поколение мощных, широко действующих нейтрализующих mAb (Burton et al., 2012; Kwong and Mascola, 2012; Klein et al., 2013b) , Эти mAb нацелены на сайт связывания CD4 (CD4bs), белок-гликановые эпитопы, связанные с областями gp120 V1 / V2, V3 и V4, и проксимальную внешнюю область мембраны gp41 (Walker et al., 2009, 2010, 2011a; Wu et al., 2010; McLellan et al., 2011; Scheid et al., 2011; Huang et al., 2012; Kong et al., 2013) и, как правило, демонстрируют большую широту и эффективность против гетерологичных изолятов ВИЧ-1 при анализе на нейтрализация in vitro. В этом исследовании пять новых нейтрализующих mAb индивидуально вводились группам макак-резусов, которые впоследствии были отдельно подвергнуты интраректально одним из двух разных SH5 SH5. Уровни ВИЧ-1 NAbs в крови и тканях измерялись во время заражения вирусом. Объединив результаты, полученные от 60 животных с двумя разными SHIV, мы определили, что титр нейтрализации плазмы, предотвращающий получение вируса, был относительно скромным (~ 1: 100) и потенциально достижимым путем вакцинации. Эти данные дают рекомендации по определению уровней нейтрализующей активности в плазме, которые должна вызывать эффективная вакцина против ВИЧ.

Чувствительность нейтрализации двух различных R5-тропических SHIVs, которые впоследствии будут использоваться в качестве вирусных проб в экспериментах с пассивным антителом перед выдержкой, описанных ниже, оценивали с использованием анализа нейтрализации клеток TZM-bl. Один из оцениваемых R5 SHIV, SHIVAD8EO (Shingai et al., 2012), является молекулярно-клонированным производным SHIVAD8 (Nishimura et al., 2010), реплицируется до высоких уровней в РВМС резус-макаков, демонстрирует фенотип чувствительности к уровню нейтрализации уровня 2 (уровень 2) Gautam et al., 2012) и генерирует устойчивые уровни плазменной виремии и истощение CD4 + Т-клеток, что приводит к симптоматическому иммунодефициту у привитых обезьян. Второй R5-тропический SHIV, SHIVDH12-V3AD8 был недавно построен путем вставки всей кодирующей области gp120 V3 с 33 аминокислотами SHIVAD8EO, которая дает возможность использовать корецептор CCR5 для ввода клетки в генетический фон ранее описанного X4 -тропный SHIVDH12-CL-7 (фиг.1 A, Sadjadpour et al., 2004). SHIVDH12-V3AD8 демонстрирует устойчивую кинетику репликации во время заражения РВМК резус-обезьяны и исключительно использует CCR5 для входа в эти клетки (фиг.1, B и C). Gp120s SHIVDH12-V3AD8 и SHIVAD8EO отличаются на 10% на уровне нуклеотидов. Их чувствительность к группе сывороток от ВИЧ-1-инфицированных лиц, проявляющих широкий спектр нейтрализующей активности, указывает на то, что оба они обладают фенотипом нейтрализации ВИЧ-1 уровня 2 (таблица 1). Резус-макаки, ​​инокулированные внутривенно или внутриретрально с SHIVDH12-V3AD8, демонстрировали пиковые уровни плазменной виремии в пределах от 105 до 107 вирусных РНК-препаратов / мл плазмы на 2-3 недели после инфицирования (PI, рис.1, D и E).

Построение и характеристика R5-тропического SHIVDH12-V3AD8. (A). Вся область gp120 V3 X4-тропического SHIVDH12-CL7 (Sadjadpour et al., 2004) была заменена областью gp120 V3 из R5-тропического SHIVAD8EO (Shingai et al., 2012) с помощью ПЦР-опосредованного мутагенеза , Красные буквы указывают на изменение аминокислот из петли SHIVAD8EO V3, придающей тропизм R5 до SHIVDH12-V3AD8. Вирусные запасы результирующего SHIVDH12-V3AD8 были приготовлены в PBMC с макрокакой Concanavalin A с использованием 293T клеточных трансфекционных супернатантов. (B) Использование корецептора SHIVDH12-V3AD8 сравнивали с использованием ранее описанного X4-тропического SHIVDH12-CL7 (Sadjadpour et al., 2004) и R5-тропического SHIVAD8EO (Shingai et al., 2012) во время входа в резус PBMC в присутствии ингибиторов CXCR4 (AMD3100) или CCR5 (AD101). Данные представляют собой два независимых эксперимента. (C) Кинетику репликации X4-тропического SHIVDH12-CL7 или R5-тропического SHIVAD8EO и SHIVDH12-V3AD8 в резус-РВМС определяли путем измерения 32P-активности обратной транскрипции, высвобождаемой в тканевую культуральную среду. Данные представляют собой два независимых эксперимента. (D и E) SHIVDH12-V3AD8 в макаках резуса после инокуляции путем внутривенного (n = 5; D) или IR (n = 5; E) маршрутов. Уровни вирусной РНК плазмы измеряли с помощью ОТ-ПЦР, как описано выше (Endo et al., 2000).

Нейтрализационные фенотипы приматов-лентивирусов.

Значения IC50 представляют собой разведение в сыворотке, при котором относительные единицы люминесценции (RLU) уменьшались на 50% по сравнению с контрольными лунками вируса (без тестового образца).

Чувствительность к нейтрализации SHIVAD8EO до 11 недавно сообщала о наиболее реакционноспособных mAb против ВИЧ-1, первоначально определялась в системе анализа TZM-bl. Восемь из этих антител (VRC01 [Zhou et al., 2010], NIH45-46 [Diskin et al., 2011], 45-46G54W [Diskin et al., 2011], 45-46m2 [Diskin et al., 2013] , 3BNC117 [Scheid et al., 2011], 12A12 [Scheid et al., 2011], 1NC9 [Scheid et al., 2011] и 8ANC195 [Scheid et al., 2011]) нацелены на CD4b gp120 и три (10 -1074, PGT121 и PGT126, Walker et al., 2011a, Mouquet et al., 2012) зависят от присутствия гликона HIV-1 gp120 N332, расположенного непосредственно после петли V3. При тестировании против SHIVAD8EO все три гликанозависимые mAb проявляли большую активность, чем mAb CD4bs (рис.2 A). Значения IC50 для трех mAb, нацеленных на гликоин gp120 N332, варьировались от 0,09 до 0,15 мкг / мл (фиг.2В). Метчики CD4bs демонстрировали гораздо более широкий диапазон (от 0,14 до 6,36 мкг / мл) активности нейтрализации IC50, причем 3BNC117 является наиболее мощным. Аналогичная иерархия (зависимая от гликанов> зависимая CD4bs) от нейтрализующей активности mAb наблюдалась также против SHIVDH12-V3AD8 (фиг.2C), но нейтрализующая активность распределялась в гораздо более широком (более 800 раз) диапазоне по сравнению с значениями IC50 наблюдаемый для SHIVAD8EO (фиг.2D). SHIVDH12-V3AD8 был несколько более чувствителен к mAb-нацеливающим mAb и более устойчив к нейтрализующим mAb CD4bs, чем SHIVAD8EO.

Нейтрализация двух R5-тропических SHIVs с панелью из 11 широко действующих анти-ВИЧ-1 mAb. (A и C). Нейтрализацию проводили с псевдовирионами SHIVAD8EO (A) или SHIVDH12-V3AD8 (C) и указанными mAb с использованием клеток-мишеней TZM-bl. Кривые титрования для глюканозависимых нейтрализующих mAb являются красными; для VRC01 в синем; и два мощных mAb CD4bs (45-46m2 и 3BNC117) в зеленом цвете. (B и D) Вычисленные значения IC50 для нейтрализации SHIVAD8EO (B) или SHIVDH12-V3AD8 (D) показаны ниже. Индивидуальные анализы повторяли три раза.

Хотя анализы нейтрализации in vitro могут предоставить важную информацию о потенции и широте антител, а также направлять разработку новых mAb с улучшенными свойствами, препятствующими проникновению, более важным критерием противовирусной эффективности является защита от заражения in vivo в экспериментах по пассивной передаче. Как отмечалось ранее, важнейшей задачей вакцинации в случае приматов-лентивирусов является защита от стерилизации. На основании результатов, показанных на фиг.2, были выбраны пять нейтрализующих mAb для исследования пассивного переноса с предэкспозицией: VRC01, поскольку он был первым характеризованным NAb для всех выделенных широко действующих NAbs; CD4bs mAb 45-46m2 и 3BNC117, оба из которых проявили сильную нейтрализующую активность как SHIVAD8EO, так и SHIVDH12-V3AD8; и gp120 N332 гликано-зависимые mAb PGT121 и 10-1074. Сравнимые, но более высокие значения IC50 для этих пяти mAb были получены в 14-d PBMC-анализе нейтрализации, используя репликационно-компетентные SHIVAD8EO или SHIVDH12-V3AD8 (таблица S1).

Протокол, используемый для экспериментов с пассивной передачей, заключался в том, чтобы вводить уменьшающиеся количества нейтрализующих mAb внутривенно и заражать животных внутриречивно через 24 часа. Поскольку наша цель состояла в том, чтобы блокировать получение вируса, а также знание о том, что повторное введение человеческих антибактериальных антител к отдельным макакам может снизить их потенцию и / или, возможно, вызвать анафилактические реакции, мы решили использовать пробную дозу SHIV достаточного размера, чтобы установить инфекция in vivo после однократной инокуляции вирусом. В связи с этим мы ранее проводили внутриретральные (IR) титрования SHIVAD8 у макак-резусов и сообщали, что инокуляция 103 TCID50, определяемая разбавлением конечной точки в РВСМ резус-макаков, эквивалентна введению инфекционных доз животных ~ 3-550 (AID50; Gautam et al., 2012). Фактически, одиночные IR-прививки от 3 до 5 AID50 привели к успешному установлению инфекции у 20 из 20 макак резуса с SHIVAD8EO или SHIVDH12-V3AD8. Патогенные молекулярно-клонированные вирусы, а не незатронутые запасы SHIV использовались в качестве инокулята для облегчения идентификации устойчивых к нейтрализации вирусных вариантов, возникающих после заражения.

В качестве контроля для первого эксперимента по пассивной передаче вирусу NS1 IgG1 вируса против лихорадки вводили внутривенно двум животным, которым через IR-день с помощью SHIVAD8EO вызывали вызов IR-путь через 24 часа. Обе обезьяны (ML1 и MAA) быстро заразились, генерируя пиковые уровни плазменной виремии от 14 до 17 d PI (рис.3 A). VRC01 был первым нейтрализующим mAb против ВИЧ-1, который был протестирован для защиты от приобретения SHIVAD8EO и вводился двум макакам в дозе 50 мг / кг. Один (DEGF) двух инокулированных макак был полностью защищен от заражения SHIVAD8EO без признаков виремии плазмы или клеточной вирусной ДНК в течение 45-недельного периода наблюдения. Другой реципиент 50 мг / кг VRC01 (DEH3) заразился, но пиковая виремия пика была отложена до 5-й недели. Два дополнительных макаки, ​​которым вводили более низкие количества (20 мг / кг) VRC01, не были защищены от заражения SHIVAD8EO (фиг.3А). Эти результаты суммированы в таблице 2.

Пассивный перенос mAb VRC01 или PGT121 и последующий вызов с помощью двух разных SH5-R5-тропических SHIV. (A и B). Плазменные вирусные нагрузки у обезьян-резусов, вводимых VRC01 или PGT121 и вызываемых IR-маршрутом через 24 часа с SHIVAD8EO (n = 14; A) или SHIVDH12-V3AD8 (n = 14; B), определяли RT -PCR. Количество mAb, вводимого внутривенно (мг / кг), указано в скобках для каждого животного. Макаки ML1 и MAA получали 20 мг / кг контрольного анти-лихорадочного вируса NS1 IgG1 mAb. Человеческий IgG у неинфицированных лиц также переносился на макаки JII и JKI как отрицательный контроль.

Концентрации и титры, нейтрализующие плазму, в момент заражения вирусом

Н. Д., не сделано.

Затем мы рассмотрели защитные свойства PGT121 против проблемы SHIVAD8EO. PGT121 был одним из наиболее мощных нейтрализующих mAb гликанов, измеренных в анализе TZM-bl (фиг.2). Исходя из результатов, полученных с помощью VRC01, и того факта, что PGT 121 был более сильным в анализе in vitro, мы начали титрование in vivo PGT121 mAb при 20 мг / кг. Как показано на фиг.3А, обе обезьяны (KNX и MK4), получающие 20 мг / кг PGT121, сопротивлялись вызову SHIVAD8EO. Когда вводили более низкие количества (5 мг / кг, 1 мг / кг или 0,2 мг / кг) PGT121, один из двух, два из двух и нуль двух животных соответственно были защищены (фиг.3А и таблица 2).

Также была оценена емкость mAb VRC01 и PGT121 для блокировки получения SHIVDH12-V3AD8 (рисунок 3 B, таблица 2). Результаты, полученные с помощью VRC01, были сопоставимы с результатами, полученными при заражении SHIVAD8EO: один из двух реципиентов 30 мг / кг был защищен от установления инфекции SHIVDH12-V3AD8. MAb PGT121 был значительно более сильным, чем VRC01, в предотвращении приобретения SHIVDH12-V3AD8; пара реципиентов 20, 1,0 и 0,2 мг / кг PGT121 сопротивлялась инфекции, но 0,05 мг / кг не было. Таким образом, PGT121 был более эффективен в предотвращении инфицирования SHIVDH12-V3AD8 по сравнению с SHIVAD8EO in vivo (таблица 2), что соответствовало 10-кратной разнице в значениях IC50 для PGT121 для нейтрализации двух SHIV в анализах in vitro (фиг.2, B и D).

Результаты пассивной передачи нейтрализующих mAb 10-1074, 3BNC117 и 45-46m2 на обезьян-резус, за которыми следуют проблемы с SHIVAD8EO или SHIVDH12-V3AD8, приведены в таблице 2. Ранее сообщалось, что 10-1074 и 3BNC117 mAbs предотвратили приобретение инфекции SHIVAD8EO при введении в дозе 5 мг / кг, но не в 1 мг / кг (Shingai et al., 2013). В случае проблем SHIVDH12-V3AD8 N332-зависимый 10-1074 mAb сильно блокировал инфекцию по 5 мг / кг и защищал одну из двух обезьян в дозе 1 мг / кг. 3BNC117 успешно предотвратил приобретение инфекции SHIVDH12-V3AD8 у одной из двух обезьян в дозах 5 мг / кг и 1 мг / кг (таблица 2). Удивительно, но несмотря на то, что они проявляют сильную нейтрализующую активность против обоих вирусов in vitro (рис.2), mAb 45-46 м2 CD4bs не удалось блокировать приобретение SHIV при любой вводимой дозе (таблица 2).

Количество mAb, вводимого этой когорте макак, выбирали, основываясь главным образом на результатах анализов нейтрализации in vitro, показанных на фиг.2. Одна из наших целей заключалась в определении концентрации mAb плазмы, обеспечивающей стерилизационную защиту. За исключением mAb 45-46 м2, концентрации в плазме для данной дозы (например, 20 мг / кг) каждого из mAb против ВИЧ в момент заражения (через 24 часа после введения антитела) были одинаковыми у всех животных (Таблица 2). Однако концентрации в плазме различных mAb, необходимых для предотвращения приобретения SHIVAD8EO или SHIVDH12-V3AD8, сильно различались. PGT121 был явно наиболее эффективным против обоих вирусов, причем SHIVDH12-V3AD8 проявлял несколько большую чувствительность к этому mAb (две из двух обезьян, защищенных при концентрации в плазме 0,2 мкг / мл). Напротив, для защиты одного из двух животных от одного и того же вирусного вируса SHIVDH12-V3AD8 требовалась концентрация в плазме около 400 мкг / мл VRC01 (таблица 2). Наиболее эффективный mAb CD4bs, вводимый макакам в этом исследовании, 3BNC117, был в ~ 6-10 раз более эффективным, чем VRC01, в предотвращении приобретения либо SHIV.

Нейтрализующие уровни mAb также измеряли в нескольких тканях из двух макак резуса (A11E039 и MIB), пожертвовали через 24 часа после введения 20 мг / кг 3BNC117. Эта точка времени была выбрана потому, что она соответствует времени SHIV-теста в экспериментах с пассивной передачей. Реплицированные образцы были получены из 11 различных тканей каждого животного во время вскрытия. Тройные клеточные лизаты T-PER или суспензии клеток PBS независимо получали и анализировали для присутствия gB120-связанного 3BNC117 с помощью ELISA с использованием специфического антитела против человеческого IgG. Как показано в таблице 3, 3BNC117 не только измерялся в плазме, но и легко обнаруживался при концентрациях в пределах от 10 до 75 × ниже, чем в плазме в суспензиях репликации и лизатах из множественных лимфоидных тканей, препаратах слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, вагинальных образцах и печени от обоих животных через 24 ч после введения. Несмотря на то, что уровни в тканях значительно ниже, чем уровни в плазме, уровни выше, чем уровни, необходимые для нейтрализации in vitro. Сопоставимые уровни mAb также были обнаружены в тех же реплицированных тканевых суспензиях и лизатах у обезьяны A11E039, когда в ELISA (неопубликованные данные) использовали анти-идиотип, специфичный для 3BNC117. Антитело против ВИЧ не было обнаружено в тканевых суспензиях или лизатах, полученных из контрольного животного (ELB), которое не получало 3BNC117.

Концентрации NAb в тканях через 24 часа после пассивного переноса

Н. Д., не сделано. T, время сбора образцов после администрирования NAb

Мы также попытались измерить антитела против ВИЧ на влажных поверхностях нелимфоидных тканей сразу же после их удаления при вскрытии. Целлюлозные фитилы наносят в трех экземплярах на эти образцы в течение 5 мин, чтобы поглощать поверхностные выделения, взвешивать, центрифугировать в колонках фильтрацетата целлюлозы и анализировать на антитела к ВИЧ в фильтрате с помощью ELISA. Как показано в таблице 3, 3BNC117 был обнаружен на поверхности образцов слизистой оболочки влагалища обе обезьян, но был ниже уровня обнаружения в анализах образцов желудочно-кишечного тракта. Высокие уровни антител к ВИЧ, обнаруженные в образцах печени с фитильной системой, скорее всего, отражают 3BNC117 в крови на срезанных поверхностях этого органа. В совокупности результаты, представленные в таблице 3, демонстрируют, что внутривенное введение анти-ВИЧ-нейтрализующего mAb быстро и системно распространяется в ткани и присутствует на уровнях, способных блокировать установление инфекции SHIV в месте заражения вирусом.

Неэффективность и неожиданно низкие уровни плазмы mAb 45-46 м2 (таблица 2) привели нас к определению скоростей распада всех пяти нейтрализующих mAb, вводимых макакам (рис.4). Вычисленные периоды полураспада PGT121, 10-1074, 3BNC117 и VRC01 mAb были весьма похожими: 3,5, 3,5, 3,3 и 3,1 d соответственно. Напротив, период полураспада 45-46 м2 не определялся напрямую. На основании концентраций mAb плазмы в нескольких макаках через 24 ч после введения 20 мг / кг нейтрализующих mAb VRC101, PGT121, 10-1074 и 3BNC117 (~ 250 мкг / мл, таблица 2) обе обезьяны, получающие 20 мг / кг 45-46 м2 имели концентрацию mAb в плазме только 15,0 и 17,6 мкг / мл, что представляет собой спад> 95% по сравнению с другими нейтрализующими mAb в течение 24 ч введения (фиг.4). Таким образом, несмотря на высокую эффективность, измеренную in vitro (рис.2), 45-46m2 неэффективен для макак.

Уровни нейтрализующих mAb в плазме пассивно перенесенных макак. Концентрации указанных mAb в плазме в различные моменты времени после введения определяли с помощью ELISA с использованием рекомбинантного HIV-1 gp120. Уровни плазменных антител измеряли у животных, описанных в таблице 2. Показаны средства и SD.

Концентрации плазменных антител для каждого из пяти анти-ВИЧ моноклональных NAbs, обеспечивающих стерилизационную защиту от SHIVAD8EO или SHIVDH12-V3AD8, показаны на рисунке 5 A. Эти защитные концентрации варьировались от 587 до 1,6 мкг / мл (таблица 2). Титрами нейтрализующей активности в плазме обезьян во время заражения SHIV являются более информативная и функциональная метрика циркулирующих NAB против ВИЧ-1, чем их концентрации IgG. Представление данных в этом формате было бы явно актуальным для разработки вакцины, где титры циркулирующей антивирусной нейтрализующей активности, а не концентрации плазменных антител, могли быть сопоставлены с защитой in vivo. Поэтому титры нейтрализации измеряли на образцах плазмы, собранных через 24 часа после введения mAb, когда макакам вводили SHIVAD8EO или SHIVDH12-V3AD8 (таблица 2). Когда это делается, относительно слабый mAb, такой как VRC01, при введении в дозе 30 или 50 мг / кг генерирует защитные титры нейтрализации плазмы в диапазоне 1: 100, тогда как более мощный моноклональный моноклональный антитело PGT121 может достичь такого же уровня активность после введения только 0,2 мг / кг. Титры нейтрализации во всей когорте макак во время заражения вирусом, а также у тех, кто защищен от инфекции, показаны графически на рисунке 5 В. Это представление о нейтрализации плазмы показывает, что титр нейтрализации ~1: 100 может быть возможный порог, необходимый для предотвращения заражения вирусом.

Уровни нейтрализующих mAb в плазме пассивно переносимых макак во время заражения. (A) Концентрации (мкг / мл) указанных mAb в плазме через 24 часа после пассивного переноса mAb определяли с помощью ELISA с использованием рекомбинантного HIV-1 gp120. (B) Титры IC50 плазмы указанных mAb через 24 часа после пассивного переноса mAb определяли с использованием анализа клеток TZM-bl. Красные круги указывают на защищенные (без приобретения) обезьяны; черные круги обозначают зараженных животных. Уровни плазменных антител и титры NAb измеряли у 60 животных, описанных в таблице 2.

Метод, описанный Ридом и Мюнхом (1938), был затем использован для расчета титров нейтрализации, измеренных в плазме, необходимых для предотвращения заражения вирусом у 50% оспоренных обезьян. Эти защитные титры для 28 обезьян, спровоцированных SHIVAD8EO, или 32 обезьян, зараженных SHIVDH12-V3AD8, были отдельно выведены (таблицы S2 и S3). Титры для нейтрализации плазмы, необходимые для защиты 50% животных, зараженных SHIVAD8EO или SHIVDH12-V3AD8, были рассчитаны как 1: 115 и 1:96 соответственно. Поскольку эти два титра были очень похожими и были получены после введения того же ансамбля нейтрализующих mAb на 60 животных, вызываемых одинаковыми путями и размером инокулюма, но с двумя SHIV, несущими генетически различные гликопротеины оболочки, данные нейтрализации от всех обезьян были объединены и подвергнуты пробит регрессии для определения взаимосвязи между титрами нейтрализации плазмы и защитой in vivo (Finley, 2007). В качестве дополнительной проверки, когда термин для вируса SHIV был включен в модель регрессии пробит на всех 60 макаках, не было доказательств разницы между двумя вирусами SHIV (P = 0,16). При применении ко всей группе из 60 макаков ремиссия пробит оценивалась, что титр нейтрализации плазмы 1: 104,5 предотвращает получение вируса у 50% животных (фиг.6). Вставка внизу рисунка 6 предсказывает титры нейтрализации, определенные методом TZM-bl и рассчитанные с помощью регрессии пробит, необходимые для защиты различных пропорций популяции обезьян, подверженных воздействию SHIV. Например, для защиты 80% оспариваемых животных потребуется титр нейтрализации 1: 328,7 с предостережением о том, что 90% -ный доверительный интервал титров для достижения этого результата довольно велик (от 1: 152 до 1: 632).

Анализ регрессии Probit, связанный с титрами NAb во время вызова вируса и вероятности защиты. Черные круги обозначают обезьян с SHIVAD8EO; красные круги обозначают обезьян SHIVDH12-V3AD8. Горизонтальные линии указывают 90% доверительные интервалы титров нейтрализации плазмы на 33, 50, 80, 90 и 95% вероятности защиты. Оценочные титры нейтрализации в плазме, обеспечивающие различные уровни защиты и соответствующие 90% доверительные интервалы, показаны внизу рисунка.

Это исследование имеет более широкие последствия, помимо простого проведения другого эксперимента с пассивным переносом, с использованием недавно разработанных широких и мощных анти-ВИЧ-нейтрализующих mAb. Он достигает оптимистического вывода о том, что если иммуноген можно идентифицировать / спроектировать, чтобы выявить широту анти-ВИЧ-нейтрализующей активности, обладающей некоторыми из новых моноклональных антител нового поколения, вакцина, содержащая такой иммуноген, может создавать только умеренные защитные титры, чтобы предотвратить установление инфекции. Следует отметить, что размер вирусного инокулюма (3-5 AID50), использованный в этом исследовании, был выбран для обеспечения того, чтобы все обезьяны были инфицированы после одной ИК-инокуляции. Эта контрольная доза на несколько порядков выше, чем предполагалось, чтобы установить инфекцию ВИЧ-1 после вагинального воздействия на человека (4-8 на 10000 облучений, Patel et al., 2014). Если на самом деле рассчитанный 50% защитный титр ~ 1: 100 против вирусной угрозы 3-5 AID представляет собой грубую завышенную оценку, то истинный защитный титр может быть смягчен недавними исследованиями, в которых сообщается, что в 10-20 раз выше уровней нейтрализующей активности необходимы для блокирования распространения клеточного вируса в тканевых культурах (Abela et al., 2012; Malbec et al., 2013).

Идентификация и развитие иммуногенов, способных индуцировать нейтрализующие действия, обладающие широтой новейших поколений антивирусных mAb и генерирующих титры плазмы в диапазоне 1: 100, представляют собой серьезную проблему, стоящую перед полем вакцины против ВИЧ. Несколько исследований вакцин иммунизировали макаки с помощью гликопротеина оболочки SHIVSF162P4 или его производного gp120V2del (Barnett et al., 2008, 2010; Bogers et al., 2008; Page и др., 2012). Другие использовали тримеры gp120 ВИЧ-1YU-2 (Sundling et al., 2010a, b) или тримеризованные консенсус-белки HIV-1 gp140 (Eugene et al., 2013). Защитную эффективность оценивали с использованием простых для нейтрализации вирусных проблем, таких как тесно связанные SHIVSF162P4 или SHIV89.6P, и SHIVsbg. В некоторых случаях умеренные уровни антивирусной нейтрализующей активности против некоторых изолятов ВИЧ-1 уровня 1 были индуцированы до заражения вирусом, и в некоторых случаях заражение гомологичным вирусом оказалось блокированным (Bogers et al., 2008; Barnett et al., 2010). Тем не менее, уровни NAbs, обеспечивающие стерилизационную защиту, не могут быть легко определены из этих исследований. Например, в одном исследовании с использованием гомологичной проблемы вирус был необнаружим у пяти из восьми вакцинированных обезьян с предраковыми анти-SHIVSF162P4 NAb титрами от 1:80 до 1: 700 (Bogers et al., 2008). В другом исследовании гетерологичное поглощение SHIVSF162P4 блокировалось у 2 из 4 животных, вакцинированных тримерами консенсусной консенсус HIV-1 gp120, которые индуцировали нейтрализующие титры против ВИЧ-1SF162 1:40 и 1: 320 (Eugene et al., 2013) , Тем не менее, один из двух защищенных макак переносил аллель Mamu B * 08 MHC и другой вирус, высвобождаемый животным, после введения истощающего mAb против CD8, M-T807R1, что указывает на то, что захват SHIV не был заблокирован. Недавнее исследование, в котором использовались вакцины на основе аденовируса и поксвируса на основе век, которые экспрессировали мозаичные иммуногены ВИЧ-1 Env / Gag / Pol, индуцировали титры NAb в диапазоне 1:69-1: 153 против вирусных штаммов уровня 1 в макаках резуса (Barouch et al. ., 2013a). Этот последний режим вакцинации, а затем повторные проблемы с низкой дозой с трудно нейтрализующим SHIVSF162P3, снизили риск заражения вирусом на риск на 90%.

Более ранние исследования пассивного переноса оценивали защитные концентрации, нейтрализующие плазму и / или титры нейтрализации, с использованием множества менее мощных и более узко сфокусированных mAb, X4- или R5-тропических SHIV и различных путей инокуляции (Mascola et al., 1999; Shibata et al., 1999; Parren et al., 2001; Hessell et al., 2010). Например, недавно сообщалось, что титры, нейтрализующие плазму в диапазоне от 1: 200 до 1: 495, достигнутые после введения одного мощного mAb против ВИЧ (PGT121), защищают 3 из 5 макак от вагинального заражения с помощью R5- tropic SHIVSF162P3 (Moldt et al., 2012). Обоснованный защитный нейтрализационный титр, описанный в нашем исследовании, был рассчитан для когорты из 60 получателей макаки из 5 различных мощных антибактериальных антител против ВИЧ и был спровоцирован любым из двух R5-тропических SHIV по ИК-маршруту. Также стоит отметить, что нейтрализующие титры в диапазоне 1: 100 достижимы иммунной системой человека, основанные на недавнем исследовании, показывающем, что 34% из 463 сывороток хронически ВИЧ-инфицированных индивидуумов нейтрализуют титры> 1: 100 при испытании против вирусные штаммы из 4 или более ВИЧ-1 кладов (Simek et al., 2009). Учитывая оговорки относительно размера инокулюма 3-5 AID50, использованного в этом исследовании, указанное значение 1: 100 не следует рассматривать как жесткое и фиксированное число, о чем свидетельствуют титры, измеренные в некоторых незащищенных макаках. Он был рассчитан по результатам, полученным от большого числа животных, и должен считаться минимальным числом, которое должно быть достигнуто новым поколением иммуногенов.

Что касается создания скромных защитных нейтрализующих титров, предотвращающих получение вируса, теперь считается, что очень большое количество генетических изменений (40-100 нуклеотидов), участвующих в созревании В-клеток, способных продуцировать мощные и широко действующие анти-ВИЧ NAbs, представляет собой серьезное препятствие для разработки эффективной вирусной вакцины (Scheid et al., 2009; Walker et al., 2009, 2011a; Xiao et al., 2009; Wu et al., 2010; Scheid et al., 2011; Mouquet et al. al., 2012; Klein et al., 2013a). Это число намного превышает нуклеотидные изменения, необходимые для получения защитных антител против большинства других вирусных патогенов, и делает проект эффективного иммуногена наиболее сложной задачей. Для решения этой проблемы было предложено несколько возможных решений. Один из них, предложенный из естественных ВИЧ-инфекций человека и SHIV-инфекций макак, включает в себя идентификацию и использование уникальных гликопротеинов оболочки ВИЧ-1, способных определять развитие сильной нейтрализующей активности после первоначального столкновения с иммунной системой (Walker et al. , 2011b; Shingai et al., 2012; Klein et al., 2013b; Doria-Rose et al., 2014). Другой использует эпитоп-ориентированные и основанные на основах иммуногены, аналогичные тем, которые недавно были представлены для противовирусной вакцины с синцитиальным вирусом (Correia et al., 2014), которые специально нацелены на структурно определенные эпитопы для известных защитных NAbs и которые также способны взаимодействуют с зародышевой IgG (Jardine et al., 2013; Klein et al., 2013b).

Из этого исследования вышли два интересных вывода, относящихся к выбору и клиническому использованию противовирусных нейтрализующих mAb. Во-первых, внутривенное введение таких антител приводило к их быстрому распространению системно. Они стали обнаруживаться в нескольких лимфоидных и слизистых тканях в течение 24 часов, достигая уровней активности, достаточных для блокирования заражения вирусом даже при введении при дозе 0,2 мг / кг. Во-вторых, нейтрализация вируса, измеренная in vitro, не является абсолютно прогнозирующей нейтрализующей активностью, достигнутой in vivo. Хотя результаты, полученные с использованием анализа клеток TZM-bl, хорошо коррелировали с защитными эффектами in vivo для четырех (PGT121, 10-1074, 3BNC117 и VRC01) mAb против ВИЧ (фиг.2 и таблица 2), в vitro спроектировал 45-46 м2 CD4bs mAb, который проявлял очень высокую активность in vitro, был полным провалом in vivo. Он проявлял чрезвычайно короткий период полувыведения в плазме, при этом активность циркуляции в течение 24 часов после введения оставалась только на ~ 5%.

Распад in vivo широко действующих антибактериальных mAb, используемых в этом исследовании, был относительно коротким (период полураспада = 3,5 d), скорее всего, отражая их человеческое, а не макачное происхождение, что, скорее всего, способствовало этому быстрому спаду. Тем не менее, сообщалось, что введение нейтрализующей mAb терапии с высокой дозой, включая три из оцениваемых здесь антител (3BNC117, 10-1074 и PGT121), недавно подавляло подавление плазменной виремии до пределов обнаружения хронически SHIVAD8- или SHIVSF162 (Barouch et al., 2013b; Shingai et al., 2013). В связи с этим, до разработки эффективной вакцины, предэкспозиционная иммунопрофилактика против вирусной инфекции гепатита А путем введения внутримышечно 0,06 мл / кг иммунного глобулина была обычной практикой и обеспечивала защиту на 3-5 месяцев (Консультативный комитет по практике иммунизации и др. , 2006). Поэтому нецелесообразно предусматривать будущее развитие и использование реинжиниринговых производных антибактериальных антител против ВИЧ в течение длительного периода полураспада. Генетическая модификация существующих mAb против ВИЧ может продлить их нейтрализующую деятельность in vivo в течение длительных периодов времени, позволяя полугодичную или годовую иммунизацию в качестве альтернативы вакцинации.

Все животные были размещены и ухаживали в соответствии с Американской ассоциацией по аккредитации лабораторных стандартов по уходу за животными в Американской ассоциации аккредитации лабораторий, аккредитованных на животных, а все процедуры и эксперименты с животными проводились в соответствии с протоколами, одобренными Институциональным Уходом за животными и Комитет по использованию Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID), Национальные институты здоровья (NIH). 60 мужских и женских макак-резусов (Macaca mulatta) индийского генетического происхождения в возрасте от 2 до 10 лет поддерживались в соответствии с руководящими принципами NIH (Комитет, 1985 год) и размещались на объекте NIAID уровня 2 биобезопасности. Флеботомии, эвтаназию и сбор образцов проводили, как описано ранее (Endo et al., 2000). Макаки, ​​используемые в этом исследовании, были отрицательными для аллеля MHC класса I Mamu-A * 01. Для прививок SHIV для мягкого открытия прямой кишки использовали детское зеркало, и в полость ректальной полости медленно вводили суспензию вируса в 1 мл туберкулинового шприца.

ПЦР-мутагенеза, с праймерами, соответствующие 5 ‘и 3′ половин SHIVAD8EO V3 gp120, кодирующую область (прямой праймер (Шингай и соавт, 2012.): 5’-AGAGCATTTTATACAACAGGAGACATAATAGGAGATATAAGACAAGCACATTGCAACATTAGTAAAGTAAAATGGC-3 ‘и обратный праймер: 5’-TCCTGGTCCTATATGTATACTTTTCCTTGTATTGTTGTTGGGTCTTGTACAATTAATTTCTACAGTTTCATTC- 3 ‘), был использован для введения этих последовательностей V3 в генетический фон молекулярного клона pSHIVDH12-CL7 (Sadjadpour et al., 2004) с использованием полимеразы платины PFX (Invitrogen). После очистки геля продукт ПЦР обрабатывали полинуклеотид-киназой T4 (Gibco) и лигандой с тупым концом, чтобы создать pSHIVDH12-V3AD8, который использовался для трансформации компетентных клеток.

Запасы вирусов были получены с помощью первых трансфекционных клеток 293Т с молекулярными клонами SHIVAD8EO (Shingai et al., 2012) или SHIVDH12-V3AD8 с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Супернатанты культуры собирали через 48 часов, а аликвоты хранили при -80 ° С до использования. Конканавалин A-стимулированные резус-РВМС (2 × 106 клеток в 500 мкл) инфицировали трансфецированными клеточными супернатантами спинолитированием (O’Doherty et al., 2000) в течение 1 часа, смешивали с тем же количеством / объемом активированного PBMC и культурой поддерживали в течение по меньшей мере 12 дней с ежедневной заменой культуральной среды. Образцы супернатантной среды объединяли во время пикового производства обратной транскриптазы для подготовки отдельных вирусных запасов.

11 mAb (VRC01, NIH45-46, 45-46G54W, 45-46m2, 3BNC117, 12A12, 1NC9 и 8ANC195, 10-1074, PGT121 и PGT126) выделяли и получали, как описано ранее (Zhou et al., 2010; Diskin et al., 2011, 2013; Scheid et al., 2011; Walker et al., 2011a; Mouquet et al., 2012). Компоненты 45-46G54W и 45-46m2 были предоставлены П. Марковецьо и Х. Гао (Калифорнийский технологический институт, Пасадена, Калифорния). DEN3, вирус NSG-специфического человеческого IgG1 вируса лихорадки (Moldt et al., 2012) или контрольный человеческий IgG (NIH Nonhuman Primate Reagent Resource) использовали в качестве отрицательных контрольных антител в этом исследовании. MAb, выбранные для пассивного переноса предэкспозиции, вводили внутривенно за 24 часа до заражения вирусом.

Уровни вирусной РНК в плазме определяли с помощью ПЦР обратной транскрипции в реальном времени (система обнаружения последовательности Prism 7900HT, Applied Biosystems), как сообщалось ранее (Endo et al., 2000).

Концентрации вводимых mAb в плазме обезьян определяли с помощью ELISA с использованием рекомбинантного HIV-1JRFL gp120 (Progenics Pharmaceuticals) или HIVIIIB (Advanced Biotechnology Inc.), как описано ранее (Parren et al., 2001). Короче говоря, микротитровальные планшеты покрывали 2 мкг / мл ВИЧ-1 gp120 и инкубировали в течение ночи при 4 ° С. Планшеты промывали PBS / 0,05% Tween-20 и блокировали 1% (об. / Об.) BSA. После блокировки серийное разведение антител или образцов плазмы добавляли к пластине и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Связывание было обнаружено козьим античеловеческим IgG F (ab ‘) 2 фрагментом, связанным с щелочной фосфатазой (Thermo Fisher Scientific) и визуализированным с помощью SIGMAFAST OPD (Sigma-Aldrich). Период полураспада нейтрализующих mAb рассчитывали по формуле одного экспоненциального распада, основанной на концентрациях плазмы, начинающихся на 5-й день или 7-й день после введения антител (Hessell et al., 2010).

Следующие ткани были собраны у двух обезьян-резусов, обезболивающих через 24 часа после введения 20 мг / кг mAb 3BNC117 или из одного контрольного животного, не получающего антитела: подмышечные, паховые, брыжеечные и толстые лимфатические узлы; или селезенки, печени, тощей кишки, толстой кишки, подвздошной кишки, прямой кишки и влагалища. Несколько независимых образцов собирали из каждого образца ткани и взвешивали (40-300 мг). Для получения клеточных суспензий три образца из каждой ткани сразу же гомогенизировали в 4 × объемах (мас. / Об.) PBS с использованием одноразовых пестиков (Axygen, Inc.) и центрифугировали при 12000 об / мин в течение 10 мин при 4 ° C. Собранные супернатанты фильтровали через 0,45 мкм по размеру Spin-X (Corning). Клеточные лизаты получали из трех других образцов из той же ткани, суспендированных в 4 × объемах (мас. / Об.) T-PER (Thermo Fisher Scientific) и гомогенизировали с использованием одноразовых пестиков. Полученные белковые экстракты центрифугировали при 12000 об / мин в течение 10 мин при 4 ° С и средний слой белка собирали и повторно центрифугировали в тех же условиях. Выделенный клеточный лизат фильтровали через колонку Spin-X с размером пор 0,45 мкм и замораживали до анализа с помощью ELISA.

Антитело на поверхностях вагинальных, кишечных, селезеночных и печеночных тканей, собранных при вскрытии, абсорбировалось на отдельных фитилях целлюлозы (WECK-CEL Cellulose, Beaver-Visitec International, Inc.) в течение 5 мин и измерялось, как описано ранее (Kozlowski et al. , 2000; Moldt et al., 2012). Вики взвешивали до и после их нанесения на отдельные образцы тканей, а затем помещали в колонку Spin-X размером 0,45 мкм. После 15-минутной инкубации в 9 × (мас. / Об.) PBS при 4 ° C фильтраты собирали центрифугированием и замораживали до анализа с помощью ELISA.

Интенсивность in vitro каждого mAb и активность нейтрализации, присутствующую в образцах плазмы, собранных из макак резуса, оценивали с помощью двух типов анализов нейтрализации: (1) анализ на вход TZM-bl с помощью псевдотипированного вируса заражения (Willey et al., 2010) или ( 2) 14-й анализ репликации PBMC с компетентным вирусом репликации (Shibata et al., 1999; Nishimura et al., 2002). Для анализа TZM-bl серийно разведенные образцы mAb или плазмы инкубировали с псевдотипированными вирусами, экспрессируя ген env, полученный из SHIVAD8EO или SHIVDH12-V3AD8, и получали путем совместного трансфекции 293T клеток с векторами pNLenv1 и pCMV, экспрессирующими соответствующие белки оболочки (Nishimura et al., 2010). Титр IC50 рассчитывали как разведение, вызывающее 50% -ное уменьшение относительных единиц люминесценции (RLU) по сравнению с уровнями в контрольных лучах вируса после вычитания контрольного RLU клеток, как описано ранее (Shu et al., 2007; Seaman et al., 2010). ). Фенотип нейтрализации (уровни уровня) молекулярного клона SHIVDH12-V3AD8 определяли методом TZM-bl-клеток (Shu et al., 2007; Wu et al., 2009; Seaman et al., 2010) с использованием образцов плазмы из когорты которые демонстрируют широкий спектр нейтрализующих активностей против изолятов ВИЧ-1 подтипа В (Dreja et al., 2010).

Вычисление нейтрализующего титра в плазме против каждого R5 SHIV, что привело к предотвращению заражения вирусом 50 или 80% животных, зараженных вирусом, было выполнено с использованием метода Рида и Мюнха (1938). Из расчета было исключено одно значительное животное-зверь (DEW7). Протребитная регрессия использовалась для моделирования зависимости между титрами в плазме, требуемой для обеспечения стерилизующей иммунитет in vivo с использованием всех 60 пассивно иммунизированных обезьян (Finley, 2007) с p-значениями этой модели на основе тестов отношения правдоподобия. Титры плазмы, необходимые для различных уровней защиты in vivo (33, 50, 80, 90 и 95%), были определены из оценок модели пробит, а метод бутстрапинга использовался для создания доверительных интервалов 90%.

В таблице S1 показаны титры нейтрализации IC50 против ВИЧ, определенные в ревматоидной РВМС. В таблице S2 показано определение титра защиты 50% против SHIVAD8EO (Reed and Muench, 1938). В таблице S3 показано определение титра защиты 50% против SHIVDH12-V3AD8 (Reed and Muench, 1938). Дополнительный материал в Интернете можно найти по адресу http://www.jem.org/cgi/content/full/jem.20132494/DC1.

Мы благодарим Кейко Томиоку и Робин Крутерс за определение нагрузки на вирусную РНК плазмы, а также Бориса Скопеца, Уильяма Магнанелли и Рахеля Петроса за усердную помощь в обслуживании животных и помощь в процедурах.

Эта работа была поддержана Программой внутрипрофильных исследований Национального института аллергии и инфекционных заболеваний, Национальными институтами здравоохранения.

Авторы не заявляют никаких конкурирующих финансовых интересов.

Используемые сокращения:
            
              AID50
              
                инфекционная доза животных50

Сайт связывания CD4

ректальное

нейтрализующее антитело

почтовая инфекция

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *