Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Динамика модуляции пула dNTP с помощью белка SAMHD1 в макрофагах, полученных из моноцитов

dNTP pool modulation dynamics by SAMHD1 protein in monocyte-derived macrophages
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4161909/

SAMHD1 деградирует дезоксирибонуклеотиды (dNTP), подавляя синтез вирусной ДНК в макрофагах. Недавно было показано, что вирусный белок X (Vpx) ВИЧ-2 / SIVsm нацеливает SAMHD1 на протеосомную деградацию и приводит к повышению уровней dNTP, что, в свою очередь, ускоряет провирусную ДНК-синтез лентивирусов в макрофагах.

Мы исследовали как зависящие от времени, так и количественные интерлей между уровнями SAMHD1 и dNTP во время множественных воздействий Vpx в макрофагах. Было отмечено следующее. Во-первых, уровень SAMHD1 был быстро снижен Vpx + VLP до неопределяемых уровней с помощью Вестерн-блот-анализа. Восстановление SAMHD1 было очень медленным с менее чем 3% от нормального уровня макрофагов, обнаруженного на 6-й день после лечения Vpx, и только на 30% восстановилось на 14 день. Во-вторых, уровни dGTP, dCTP и dTTP достигли пика в 1-й день после лечения Vpx, тогда как dATP достиг пика на 2-й день. Однако все dNTP быстро уменьшались с 3-го дня, а уровень SAMHD1 был ниже уровня обнаружения. В-третьих, когда Vpx предварительно обработанные макрофаги были повторно подвергнуты второй обработке Vpx на 7-й день, мы наблюдали повышение dNTP, которое имело более быструю кинетику, чем первая обработка Vpx + VLP. Кроме того, мы провели короткий кинетический анализ второй обработки Vpx, чтобы найти, что уровни dATP и dGTP достигли пика через 8 часов после вторичной терапии VLP. пик dGTP был последовательно выше первичного, тогда как пиковая концентрация dATP в основном была эквивалентна первой обработке Vpx + VLP. Наконец, кинетика репликации ВИЧ-1 была быстрее в макрофагах, обработанных после вторичной обработки Vpx по сравнению с начальной однократной Vpx-обработкой.

Это исследование показывает, что очень низкий уровень SAMHD1 достаточно модулирует обычно низкие уровни dNTP в макрофагах и предлагает потенциальные разнообразные механизмы Vpx-опосредованной регуляции dNTP в макрофагах.

Онлайн-версия этой статьи (doi: 10.1186 / s12977-014-0063-2) содержит дополнительный материал, доступный для авторизованных пользователей.

Стерильный альфа-мотив (SAM) и белок домена гистидина / аспарагиновой кислоты (HD) 1 (SAMHD1) был связан с синдромом Айкарди-Гутьера, который является редким аутоиммунным заболеванием [1]. В дополнение к своей роли в аутоиммунитете [2-4] SAMHD1 изучался в контексте антивирусного ответа [1,5-12] и геномной устойчивости [2,13]. Несколько групп показали, что SAMHD1 встречается во всех типах клеток и локализуется в ядре [5,10,14-19].

Недавние данные свидетельствуют о том, что SAMHD1 имеет по меньшей мере две различные клеточные функции. Во-первых, было показано, что SAMHD1 обладает активностью дезоксирибонуклеозидтрифосфата (dNTP) фосфогидролазы [20,21], предполагая, что он является антивирусным рестрикционным фактором хозяина, чтобы ограничить тиражирование ретровирусных и ДНК-содержащих вирусов путем истощения клеточных dNTP в вирусных не делящихся типах клеток-мишеней [ 22-25]. В последнее время как биохимические, так и структурные данные свидетельствуют о том, что SAMHD1 образует тетрамер в качестве активного комплекса dNTP фосфогидролазы [26-29]. Когда dNTPs связываются в активном сайте, образуется тетрамер, и тетрамеру предлагается быть долгоживущим в клетке [30]. Тетрамер SAMHD1 может поддерживать концентрации клеточного dNTP на очень низком уровне за пределами S-фазы клеточного цикла. Во-вторых, было показано, что SAMHD1 обладает нуклеазной активностью. Активность нуклеазы была локализована в домене HD SAMHD1 [31]. Сообщалось о двухцепочечной активности ДНК и РНК-нуклеазы для SAMHD1 [29,32].

Регулирование SAMHD1 происходит с помощью трех механизмов. Во-первых, было показано, что метилирование промотора ингибирует транскрипцию [33], что приводит к снижению уровней SMAHD1. Во-вторых, SAMHD1 регулируется во время фазы S [34,35], предназначенной для деградации. В-третьих, было показано, что фосфорилирование SAMHD1 при T592 [35] регулирует его антивирусную активность, но не активность dNTP фосфогидролазы [11]. Важно отметить, что White et al. показали, что не делящиеся клетки не фосфорилируют SAMHD1 при Т592, тогда как циклические клетки действуют [11].

ВИЧ-2 и некоторые штаммы SIV кодируют дополнительный вирусный белок X (Vpx). Он обладает способностью нацеливать человеческий SAMHD1 на протеасому для деградации с помощью DCAF1-E3-убиквитин-лигазы [36-38]. Vpx взаимодействует с C-концом SAMHD1, чтобы облегчить эту деградацию [14, 39, 40]. В недавних сообщениях изучалась острая кинетика Vpx-опосредованной деградации SAMHD1 в миелоидных клетках и усиление инфекции ВИЧ-1 после лечения Vpx [8,41]. Кроме того, мы подробно описали острые эффекты Vpx-опосредованной деградации SAMHD1 в макрофагах, полученных из моноцитов [MD] [42], что привело к увеличению уровней dNTP с последующим усилением провирусной ДНК-синтеза и трансдукции MDM.

В этом отчете мы провели обширный кинетический и количественный анализ, изучающий длительные изменения концентрации dNTP и уровней SAMHD1 в течение 14 дней в первичных человеческих МДМ. Кроме того, мы лечили макрофаги либо с помощью одного или двойного лечения VLP, то есть после единственной Vpx + VLP-терапии, которая поддерживала уровни SAMHD1, снижались вестерн-блотами, а затем измеряли уровни dNTP и метаболиты клеточных нуклеотидов. В то время как SAMHD1 оставался очень низким, вторая обработка Vpx + VLP способствовала быстрому и устойчивому увеличению dNTP. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что очень низкий уровень SAMHD1 может значительно модулировать концентрации dNTP в первичных человеческих МДМ.

Ранее мы сообщали о острых эффектах лечения Vpx, содержащих вирусоподобные частицы (VLP) на первичных МДМ человека, до 48 часов [42], и отмечали, что уровни dGTP достигли пика на 1-й день и уже начали снижаться на 2-й день после лечения Vpx , тогда как белок SAMHD1 оставался необнаружимым с помощью вестерн-блот-анализа. Многие исследователи сообщили о влиянии кратковременных воздействий Vpx на различные типы клеток [8,18,19,41-43]. В этом исследовании мы исследовали восстановление SAMHD1 и изменения во всех четырех концентрациях dNTP в течение 14 дней для лучшего понимания клеточной биологии SAMHD1 в первичной человеческой МДМ, обработанной Vpx- или Vpx + VLP. Как показано на фиг. 1А, SAMHD1 остается неопределяемым в условиях иммуноблота, описанных в предыдущих исследованиях, до 5-го дня, что согласуется с длинным периодом полураспада Vpx [6]. Vpx имеет период полувыведения 30 ч, предполагая, что он будет разлагаться на 5-й день после лечения VLP + VLP. Количественный анализ уровня белка SAMHD1 (20 мкг) у трех доноров (рис. 1B) показал, что на 6-й день уровень SAMHD1 был ниже 3% от нормального эндогенного уровня SAMHD1, обнаруженного в MDM, что было подтверждено загрузкой 3 × ( 60 мкг) количество белка в день 6 (фиг. 1С). Важно отметить, что SAMHD1 начал восстанавливаться до последовательно обнаруживаемого уровня около 7 дня и продолжал восстанавливаться до 30% -ной экспрессии на 14-й день (рисунок 1A). Эти данные показывают, что однократное лечение Vpx + VLP может вызвать очень длительную фазу восстановления SAMHD1 в МДМ с последующим медленным восстановлением белка.
Анализ одиночной VLP-терапии в МДМ. (А) МДМ обрабатывали Vpx- или Vpx + VLP, начиная с 0-го дня, и клеточные лизаты собирали каждые 24 ч до 14 дня. Иммуноблоты исследовали на SAMHD1 или GAPDH, контроль загрузки. Отображается один представитель MDM-донора из трех человек. (B) Количественное определение экспрессии SAMHD1 (20 мкг) с помощью Вестерн-блот-анализа показано для трех независимых доноров MDM. Данные строятся путем установки уровня экспрессии SAMHD1 в день от 0 до 100%. Двунаправленный ANOVA был выполнен с помощью теста после тестирования Bonferroni для определения значимости, *** = P <0,001; ** = P <0,01. (C) Вестерн-блот-анализ с использованием общего белка 60 мкг, 3 × по сравнению с (B). Уровень экспрессии SAMHD1 ниже 3% даже при большей нагрузке. (D-G). Анализ dNTP на основе RT RT использовался для определения уровней dATP (D), dGTP (E), dCTP (F) и dTTP (G). Данные собираются в течение 15 дней, когда образцы были собраны. Был выполнен двухсторонний анализ ANOVA и существенные различия, обозначенные на графиках для dATP и dGTP.

Затем мы использовали наш высокочувствительный анализ dNTP на основе ВИЧ-1 на основе RT [44] для изучения эффектов на пулы dNTP после Vpx-опосредованной деградации SAMHD1 у тех же доноров MDM, которые использовались на рисунке 1B. Как показано на рисунках 1D-G, увеличение всех четырех dNTP было четко обнаружено после лечения Vpx + VLP в MDM. dATP и dGTP (рис. 1D и 1E) были значительно увеличены, а концентрации dCTP и dTTP (рис. 1F и 1G) были лишь незначительно увеличены. концентрация dGTP достигла максимума на 1-й день, что соответствует нашим опубликованным результатам [42]. Важно отметить, что dATP достиг пика на 2-й день до начала схватывания, что указывает на то, что модуляция dNTP была различной для каждого из нуклеотидов. Сокращение dNTP имело место, даже несмотря на то, что белок SAMHD1 оставался неопределяемым на 3-5 дней по Вестерн-блот-анализу. В основном, быстрое восстановление dNTP после его острого повышения по Vpx произошло намного раньше восстановления SAMHD1. Эти данные свидетельствуют о том, что уменьшение уровней dNTP может быть не зависящим от общего уровня белка SAMHD1 из-за различных возможностей, которые обсуждаются ниже.

Точка 7-го дня после одиночной Vpx + VLP-терапии MDM (рисунок 1B) предоставила нам уникальную возможность проверить, влияет ли двойная (2 ×) Vpx + VLP-терапия на концентрации dNTP, когда SAMHD1 составляет менее 5% от нормальной Уровень SAMHD1. Для этого теста двойная обработка Vpx + VLP проводилась на 7-й день после первичной обработки VLP, и образцы собирали каждые 24 часа с 7-14 дней (дополнительный файл 1). Мы предположили, что пик в производстве dNTP во время двойной Vpx + VLP-терапии мог быть пропущен при проведении кинетического анализа в 24-часовой момент времени. Таким образом, как показано на рисунке 2A, мы провели более жесткий острый кинетический анализ dNTP, начиная с 7-го дня после двойной Vpx + VLP-терапии в MDM и через несколько часов после двойной обработки. Как показано на фиг.2B-E, вторая обработка Vpx + VLP показала ускоренное усиление dNTP, которое достигло пика около 8 ч для dATP (фиг. 2B) и dGTP (фиг. 2C). Еще более удивительно, что dCTP (рис. 2D) и dTTP (рис. 2E) достигли пика при 1-2-часовой обработке VLP. В принципе, двойные обработанные Vpx + VLP MDMs приводили к ускоренному увеличению концентрации dNTP по сравнению с одиночной Vpx + VLP-обработкой [42]. Несколько возможных сценариев могут объяснить более быстрое повышение dNTP, вызванное второй обработкой Vpx + VLP. Во-первых, в дополнение к его способности содействовать деградации SAMHD1, мы предполагаем, что Vpx также может активировать общие пути биосинтеза dNTP. Альтернативно, активность рибонуклеотидредуктазы (RNR) посредством модуляции обратной связи с помощью клеточного dATP была как-то изменена с первичной и второй Vpx + VLP-терапии. Это поможет объяснить довольно быстрое сокращение концентрации dNTP после второй обработки Vpx + VLP. Мы не видели модуляции в субъединицах RNR после Vpx + VLP-обработки (дополнительный файл 2), но мы не смогли исключить возможность Vpx-модуляции активности RNR неизвестным механизмом. Другим потенциальным механизмом является то, что Vpx может ориентироваться на предполагаемую небольшую популяцию SAMHD1, которая может быть фосфорилирована. Предварительные данные показывают, что МДМ могут иметь pSAMHD1 в популяции T592, но как время в культуре, так и восстановление белка SAMHD1 после лечения Vpx + VLP показали потерю и отсутствие фосфорилированного SAMHD1 соответственно (дополнительный файл 3). Это исключает модуляцию концентраций dNTP фосфорилированием SAMHD1 во время фазы восстановления SAMHD1 (дни 7-14). Рисунок 2
Более быстрый рост dNTP после двойной Vpx + VLP-терапии в MDM. (A) Схема, иллюстрирующая экспериментальную конструкцию. МДМ обрабатывали VLP в дни 0 и 7, за которыми следовала коллекция клеток для dNTP в течение следующих 48 часов. (B-E) Анализ концентраций dNTP с использованием теста на основе RT. Значительные различия в концентрациях dATP (B) и dGTP (C) показаны при сравнении 2 × Vpx-VLPs (желтые полосы) и 2 × Vpx + VLP (красные полосы) групп при 0, 1, 2, 4, 8, 12 , 24 и 48 часов после добавления VLP. dATP (A) и dGTP (B) показывают пик через 8 ч после добавления VLP, тогда как dCTP (C) и dTTP (D), как представляется, достигнут пика через 1-2 часа после добавления. Значительные различия определялись сначала с использованием однонаправленного ANOVA, а затем сравнивали каждую группу с использованием анализа Манна-Уитни. *** обозначает P <0,001.

Затем мы исследовали, как однократное и двойное лечение Vpx + VLP влияет на трансдукцию ВИЧ-1 в МДМ. Для этого мы использовали вектор D3HIV-GFP, который кодирует весь геном ВИЧ-1, за исключением env и nef, которые удаляются и заменяются eGFP. Как показано на фиг. 3А, в среду 0 была добавлена ​​одиночная VLP-обработка и вектор D3HIV-GFP, а затем сбор MDM в дни 1, 2 и 7 для анализа FACS. Как показано на фиг.3В, МДМ обрабатывали в течение дней 0 и 7 VLP, а затем на день 7 добавляли вектор D3HIV-GFP. МДМ собирали в дни 8, 9 и 14 (соответствующие дням 1, 2 и 7 после D3HIV -GFP-векторное дополнение). Эффективность векторной трансдукции измеряли путем контроля экспрессии eGFP с помощью анализа FACS от двух независимых доноров MDM и графитировали в течение 1, 2 и 7 дней после трансдукции D3HIV-GFP (рис. 3C и 3D). MDM, обработанные Vpx-VLP и D3HIV-GFP, имели примерно 5% трансдукцию на 7-й день после трансдукции (см. Белые полосы на рис. 3C и 3D). Одиночная терапия Vpx + VLP (черные полосы на рис. 3C и 3D) улучшила перенос вектора ВИЧ-1 до ~ 30% трансдукции на 7-й день по сравнению с Vpx-VLP-обработкой (~ 5% на 7-й день). Однако двойная обработка Vpx + VLP (красные полоски) способна индуцировать 50-60% трансдукцию на 7-й день по сравнению с одной обработкой Vpx + VLP (черные полосы). В совокупности эти данные подтверждают, что более быстрое увеличение dNTP с помощью двойной Vpx + VLP-терапии способствовало дальнейшему усилению трансдукции ВИЧ-1 в MDM. Рисунок 3
Более быстрая трансдукция в двойных обработанных Vpx + VLP MDM. (A) Диаграмма, показывающая экспериментальную процедуру для одиночной VLP-терапии МДМ. Обработка VLP и D3HIV происходила на 0-й день, после чего собирали клетки для анализа FACS в дни 1, 2 и 7. (B) Иллюстрация, изображающая экспериментальную конструкцию с использованием двух процедур VLP, происходящих в дни 0 и 7. Обработка D3HIV проводилась на день 7. Клетки собирали в дни 8, 9 и 14, соответствующие дням 1, 2 и 7 соответственно, после добавления вектора D3HIV к среде. (CD) Анализ FACS, контролирующий частоту GFP + MDM для двух независимых доноров, обработанных одним VLP: Vpx- (белые полосы), Vpx + (черные полосы) или двойные VLP: Vpx- (желтые полосы) и Vpx + (красные полосы ). Значительные различия определялись сначала с использованием однонаправленного ANOVA, а затем сравнивали каждую группу с использованием анализа Манна-Уитни. *** обозначает P <0,001.

Общие пути биосинтеза dNTP имеют больше промежуточных звеньев, чем то, что может измерить наш анализ на основе dNTP на основе ВИЧ. Поскольку мы наблюдали более быстрое повышение dNTP с помощью двойной Vpx + VLP-терапии по сравнению с одиночной Vpx + VLP-обработкой (рис. 2) и что быстрое восстановление dNTP, наблюдаемое до появления любого обнаружимого SAMHD1, (см. Рис. 1), мы контролировали метаболические изменения во всех трех промежуточных предшественниках dNTP: метаболиты дезоксинуклеозидмонофосфатов (dNMP) и дифосфатов (dNDP) и трифосфатов (dNTP), используя количественную технологию LC-MS / MS [45]. Для этих исследований MDM обрабатывали либо одиночными дозами VLP, и клетки собирали для dNTP через 24 часа. Для уровней dNTP (рисунок 4A) ясно, что единственная обработка Vpx + VLP увеличивает уровни и, по крайней мере, dADP, dGDP и dCDP, тогда как dTDP находится ниже уровня обнаружения (см. # На рисунке 4B). Но двойная обработка Vpx + VLP (рис. 4D-F) также приводила к увеличению уровней dNDP, особенно пуринового dNDP, по сравнению с тем же донором MDM, обработанным Vpx-VLP. Для уровней dNMP только измерение dAMP генерирует значительно обнаруживаемые сигналы как в одиночных Vpx + VLP (рис. 4C), так и в двух обработках Vpx + VLP (рис. 4F) в MDM. Важно отметить, что анализ LC-MS / MS подтверждает, что обработка Vpx + VLP не только повышает уровни dNTP в MDM, но также промежуточных предшественниках dNTP. Поскольку в среде отсутствуют дезоксирибонуклеозиды, мы постулируем по косвенным свидетельствам, что увеличение метаболизма dNDP должно происходить за счет активации RNR. Точный механизм остается неясным и не связан с увеличением уровней белка субъединицы RNR (дополнительный файл 2). Более того, Vpx локализуется в ядре [5,10,14-19], предполагая, что он не имеет прямого взаимодействия с RNR.
LC-MS / MS анализ одиночных и двойных обработанных VLP MDM. Доноры МДМ лечились одним или двумя VLP. Клеточные лизаты анализировали с помощью анализа LC-MS / MS. Складывают изменения в метаболитах дезоксинуклеозида (A) dNTP, (B) dNDP и (C) dNMP, нанесены на график для одного лечения VLP для двух доноров MDM. # обозначает метаболиты ниже уровня обнаружения для анализа LC-MS / MS. Заполненные кружки указывают на метаболиты, которые не могут быть точно определены из-за наложения пиков с другим неопознанным метаболитом. Три донора МДМ, лечившиеся двойным VLP, имеют сложенные изменения (D) dNTP, (E) dNDP и (F) уровни dNMP.

Ранее было продемонстрировано, что гидроксимочевина, ингибитор RNR, может блокировать Vpx-опосредованное увеличение dNTP [41]. Мы исследовали вклад RNR для увеличения концентрации dNTP после Vpx-опосредованной деградации SAMHD1 в MDM. Мы впервые протестировали дозирующие дозы концентрации гемцитабина, клинически доступного ингибитора RNR [46], в течение 24 ч (дополнительный файл 4). Из этих данных мы протестировали концентрацию гемцитабина в дозе 40 и 100 нМ. Перед добавлением гемцитабина MDM предварительно обработали 22,5 ч VLP. Клетки собирали через 1,5 часа и анализировали на изменения уровней dNTP (рис. 5). Мы наблюдаем 50% -ное снижение уровней dATP (рис. 5A), dGTP (рис. 5B) и dCTP (рис. 5C) после обработки 100 нМ гемцитабином, тогда как концентрация dTTP (рис. 5D) оказывает меньшее влияние. В совокупности эти данные показывают, что RNR в значительной степени способствует общему увеличению Vpx-опосредованного увеличения dNTP в отсутствие SAMHD1. Рисунок 5
Острая экспозиция гемцитабина ингибирует дальнейшее повышение dNTP в одиночных MDM Vpx + VLP. Чтобы дополнительно подтвердить, что гемцитабин не имеет целевых эффектов, МДМ сначала обрабатывали VLP в течение 22,5 ч перед добавлением 40 и 100 нМ гемцитабина к среде. Образцы обрабатывали для dNTP через 1,5 часа после добавления гемцитабина. (A) dATP, (B) dGTP, (C) dCTP и (D) концентрации dTTP и средства для двух независимых доноров MDM. Был выполнен двухсторонний анализ ANOVA и существенные различия, обозначенные на графиках. Важно отметить, что острое воздействие гемцитабина в течение 1,5 ч вызывало гораздо большее ингибирование при дальнейшем повышении уровня dCTP, dGTP и dATP по сравнению с отсутствием контрольного образца гемцитабина, но лишь незначительное влияние на размер пула dTTP.

Это исследование началось с изучения того, как быстро уровни белка SAMHD1 возвращаются после одного лечения Vpx + VLP в течение семи дней, первичных человеческих МДМ. Мы обнаружили, что уровень SAMHD1 оставался очень низким (менее 3% от нормального уровня в макрофагах) между днями 1-6, прежде чем он стал последовательно обнаруживаться с помощью вестерн-блот-анализа на 7-й день. Было показано, что Vpx имеет длинную клеточную половину -life [6] и должны быть деградированы примерно на 5-й день после лечения VLP. Однако SAMHD1 никогда не восстанавливался до своего нормального высокого уровня даже на 14-й день, предполагая, что синтез белка de novo SAMHD1 также может быть очень медленным или отрицательно отрегулированным после лечения Vpx. Изучение уровней dNTP в течение этого длительного времени показало другое наблюдение. Уровни dNTP были значительно снижены до обнаружения уровня SAMHD1 с помощью Вестерн-блоттинга (рисунок 1A), но dNTP уменьшались начиная со второго дня для dGTP, dCTP и dTTP и 3-го дня для лечения DATP post Vpx + VLP. Таким образом, мы предполагаем, что дополнительные факторы или очень низкие уровни SAMHD1 могут регулировать размеры пула dNTP. Мы ожидали, что снижение уровня SAMHD1 на 7-й день после лечения Vpx + VLP предоставит окно возможности исследовать метаболизм клеточного dNTP во время второго воздействия Vpx + VLP. Действительно, двойная Vpx + VLP-обработка MDM на 7-й день была способна отображать ту же самую устойчивую высоту dNTP в момент времени, когда SAMHD1 оставался менее 3% от нормального уровня в MDM (рисунок 2). Мы предполагаем, что, поскольку кинетика двойного лечения происходит быстрее и данные HLPC-MS указывают на увеличение метаболитов dNDP, Vpx может содержать независимую функцию SAMHD1, которая активно способствует метаболизму биосинтеза клеточного dNTP и повышает уровень клеточного dNTP в присутствии только 3 % от нормального уровня SAMHD1. Этот потенциальный механизм не связан с нормативными положениями субъединиц RNR (дополнительный файл 2). Более того, у нас нет прямых доказательств того, что Vpx взаимодействует с любой из субъединиц RNR. Таким образом, остается неясным, как именно происходит лечение Vpx VLP и увеличение dNDP.

Интересно, что концентрации дезоксипурина трифосфата (dATP и dGTP) оставались высокими в течение нескольких дней после однократного лечения VLP, тогда как концентрации deoxypyrimidines — dCTP и dTTP показывали только временное увеличение перед возвратом к уровням базовой линии для большинства доноров MDM, протестированных в этом (рис. 1E-F). Наши данные согласуются с недавно сгенерированной мышью SAMHD1 [5], которая показывает, что концентрации DATP и dGTP были значительно увеличены у мышей с дефицитом SAMHD1 по сравнению с мышами дикого типа. Важно отметить, что двойная Vpx + VLP-обработка MDM была информативной, показав, что пик dATP и dGTP произошел примерно через 8 часов после добавления Vpx + VLP, что намного быстрее, чем наши результаты, опубликованные для dGTP по острой кинетике с помощью одного Vpx + Лечение VLP [42]. Интересно отметить, что мы наблюдали снижение уровней всех dNTP на 3-й день после лечения Vpx + VLP, что говорит о том, что оборот пула dNTP происходит по другим основным механизмам, отличным от SAMHD1. Эти другие механизмы могут включать гидролиз дезоксинуклеозиддифосфатазами [47, 48], отключение активности RNR или конверсию в энергетическую валюту для других реакций клеточных ферментов. Поскольку МДМ являются не делящимися клетками, мы можем исключить, что уменьшение dNTP после двойной обработки Vpx + VLP связано с использованием dNTP во время репликации ДНК. Однако мы не можем исключить, что активность по восстановлению ДНК происходит и потребляет dNTP. Мы постулируем, что устранение SAMHD1 может привести к установлению новой усталости модуляции пулов dNTP в ячейке, причем концентрации dATP и dGTP остаются намного выше, чем уровни dCTP и dTTP [5].

Мы использовали серию биохимических и вирусологических исследований с обширным и множественным воздействием процедур Vpx + VLP на первичные МДМ человека. Эти исследования показали, что значительная количественная разница между уровнями общего белка SAMHD1 и клеточных dNTP, когда MDM были обработаны Vpx + VLP. Одним из возможных объяснений является то, что Vpx может способствовать нацеливанию SAMHD1 на деградацию, но также способствует биосинтезу dNTP в макрофагах, поскольку мы обнаруживаем увеличение метаболитов dNDP, которые являются предшественниками dNTP. Это, в свою очередь, обеспечило бы быстрое и надежное повышение dNTP, которое необходимо для ускорения лентививной обратной транскрипции для ВИЧ-2 и SIV, а также для восстановления зазора в зазоре ДНК как часть лентивирусной интеграции [49], в клетках с чрезвычайно низким содержанием клеточного dNTP ,

В этих экспериментах использовались первичные человеческие моноциты, полученные из человеческих буйных покрытий (New York Blood Services, Long Island, NY). Это уже существующие материалы, которые являются общедоступными, и нет никакой информации, идентифицирующей предмет, связанный с материалом, полученным от этого поставщика. Таким образом, использование этих образцов не представляет исследования человеческих предметов, поскольку: 1) материалы специально не собирались для этого исследования, и 2) мы не можем идентифицировать предметы.

Первичные человеческие моноциты были выделены из периферических кровяных оболочек путем положительного отбора с использованием шариков MACS CD14 +, как описано ранее [50]. Моноциты были синтезированы в макрофаги, полученные из моноцитов (МДМ) в присутствии 5 нг / мл hGM-CSF (Miltenyl Biotec), обработанных в дни 0 и 2 созревания. МДМ использовали на 7-й день созревания для экспериментов.

Протокол выполнялся, как описано ранее [42]. МДМ лизировали 60% -ным холодным метанолом. Клеточный мусор очищали центрифугированием при 14 К об / мин. Супернатант сушили с использованием SpeedVac (Thermo Scientific). Гранулы ресуспендировали в 20 мкл воды. В анализе удлинения праймера использовали два микролитта образца. 5′-32P-концевой меченый праймер («P»; 5′-GTCCCTCTTCGGGCGCCA-3 ‘) индивидуально отжигали на одном из четырех разных шаблонов (3′-CAGGGAGAAGCCCGCGGTN-5’). Шаблон: комплекс праймеров был расширен обратной транскриптазой ВИЧ-1, генерируя один дополнительный продукт удлинения нуклеотидов («P + 1») для одного из четырех dNTP, содержащихся в образцах dNTP, экстрагированных клетками. В этом анализе молярное количество продукта P + 1 равно количеству каждого dNTP, содержащегося в экстрагированных образцах, что позволяет рассчитать и сравнить концентрации dNTP для различных обработок [44].

Колбы T225, содержащие клетки 293FT, трансфицировали 40 мкг pVpx-VLP или pVpx + VLP (любезно предоставленные доктора Флоренции Марготтин-Гогет и Натаниэль Ландау) и 20 мкг pVSVg в соотношении 1 мкг ДНК к 3 мкл полиэтилененимина (1 мг / мл). На следующий день среду отбрасывали и заменяли свежей средой DMEM (5% FBS и антибиотиками). Через 2-3 дня после трансфекции среду собирали и заменяли свежей средой. В день сбора среду центрифугировали при 1200 об / мин в течение 5 мин для удаления клеток. Супернатант затем фильтровали через мембрану 0,45 мкм (Corning Inc.) и наносили сверху 5 мл 25% сахарозной подушки (25% (мас. / Об.) Сахарозы, 10 мМ Трис-HCl [рН 7,5], 0,1 М NaCl и 1 мМ ЭДТА). VLP концентрировали при 28000 об / мин в течение 90 мин путем ультрацентрифугирования. Супернатант отсасывали и гранулы ресуспендировали в 600 мкл бессывороточной DMEM. Супернатант центрифугировали в течение 1 мин при 14 К об / мин для удаления мусора. Аликвоты (50 мкл) хранили при -80 ° С. Уровень антигена p27 определяли с использованием набора ELISA (Advanced BioScience Laboratories, Inc., Rockville MD). В экспериментах использовалось не менее 145 нг клеток р27 / млн.

Вектор pD3HIV-GFP кодирует геном ВИЧ-1 NL4-3 геном eGFP вместо гена nef ВИЧ-1 и имеет ген удаленной оболочки [44]. Для генерации вируса клетки 293FT в колбах T225 трансфицировали 60 мкг pD3HIV-GFP и 20 мкг pVSV-g, используя 140 мкл полиэтиленимина (1 мг / мл) в 37 мл среды DMEM / колбе. На первый день производства ВИЧ-1 среду отбрасывали и заменяли свежей полной средой DMEM (5% FBS плюс антибиотики). На второй день среду собирали и заменяли. Среду центрифугировали при 2500 об / мин в течение 7 мин для удаления клеточного дебриса и затем хранили при 4 ° С в колбе T75. Среднюю среду 3-го дня собирали и обрабатывали, как описано на второй день. D3HIV-GFP концентрировали, используя ультрацентрифугирование (22 К об. / Мин в течение 2 ч в роторе SW32 Ti). Гранулы ресуспендировали в 0,5 мл свободной от сыворотки среды DMEM. Впоследствии обломки удаляли центрифугированием (14 К в течение 2 мин). Аликвоты образцов (50 мкл) замораживали при -80 ° С до использования. МДМ трансдуцировали с помощью D3HIV-GFP, а затем образцы анализировали с использованием экспресс-цитометра Accuri C6, контролирующего экспрессию GFP в указанные моменты времени. Файлы данных были проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo (TreeStar).

Экстракты МДМ получали скребками с 70% метанолом и замораживанием их в течение ночи при -80 ° С. Экстракты центрифугировали при 13000 × g в течение 3 мин и супернатанты затем сушили. Полученные образцы восстанавливали в подвижной фазе ВЭЖХ для анализа LC-MS / MS, как описано ранее [51]. Короче говоря, образцы восстанавливали в 200 мкл 2 мМ NH4H2PO4 с 3 мМ гексиламина, затем анализировали на дезоксирибонуклеозиды. Образцы отделяли с использованием колонки Hypersil Gold 100 × 1 мм с использованием подвижной фазы A: ацетонитрила и B: 2 мМ NH4H2PO4 с 3 мМ гексиламина. А увеличено с 5% до 50% за 10 мин, выдерживайте 50% в течение 3 мин. Родственники m / z для продукта MS / MS переходы: от 523 до 146, от 539 до 162, от 496 до 119 и от 495 до 81 были применены для стандартных стабильных меченых изотопов и от 508 до 136, от 524 до 152, от 484 до 112 и 485 — 81 для соответствующих нуклеотидов образца, соответственно.

Образцы восстанавливали в 200 мкл 2 мМ NH4H2PO4 с 3 мМ гексиламина и затем делили на две фракции. Одной фракцией был анализ дезоксирибонуклеозидов. Образцы отделяли с использованием колонки Hypersil Gold 100 × 1 мм с использованием подвижной фазы A: ацетонитрила и B: 2 мМ NH4H2PO4 с 3 мМ гексиламина. А увеличено с 5% до 50% за 10 мин, выдерживайте 50% в течение 3 мин. Параметры прибора были оптимизированы для каждого метаболита (дополнительный файл 5).

Образцы обрабатывали в буфере RIPA, содержащем 1 мкМ DTT, 10 мкМ PMSF, 10 мкл / мл ингибитора фосфатазы (Sigma) и 10 мкл / мл ингибитора протеазы (Sigma). Клетки обрабатывали ультразвуком с импульсами 3 × 5 секунд для обеспечения полного лизиса. Клеточный мусор удаляли центрифугированием на 15 К в течение 10 мин. Супернатанты хранили при -80 ° С перед использованием. Лизаты клеток растворяли на 8% -ном геле SDS-PAGE. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и детектировали, как описано в легендах фигуры, используя следующие антитела: mAb против SAMHD1 кролика (Abcam), mAb против GAPDH мыши (Santa Cruz). Анти-мышь и антитела против кроликов вторичной HRP были приобретены у GE HealthScience. HRP определяли с использованием хемилюминесцентных реагентов (Pierce) в соответствии с инструкциями производителя. Изображения были захвачены с использованием BioRad ChemiDoc Imager. Антитело против pSAMHD1 T592 было получено от доктора Диас-Грифферто.

Программное обеспечение Prism использовалось для построения данных. Все данные были сопоставлены для существенных различий с использованием двухстороннего анализа ANOVA и послетестового анализа Bonferroni для значимости.

Дополнительный файл 1:
              
                
Двойной кинетический анализ Vpx + VLP. (A) Диаграмма, показывающая режим лечения для однократного и двойного лечения VLP и дней, собранных после лечения. (B-E). Анализ ДНК-1 на основе RT-1 проводили на образцах для определения концентраций четырех различных метаболитов. Для определения существенных различий в каждой из указанных групп (*, Р <0,05; **, Р <0,01 и ***, Р <0,001) применялся двухсторонний ANOVA. Анализ проводился для двух независимых доноров МДМ.

Анализ субъединиц RNR. МДМ обрабатывали VLP в течение 24 ч и затем обрабатывали для клеточных лизатов. Вестерн-блот-анализ проводили с использованием общего белка 25 мкг для обнаружения основной субъединицы R1 (Abcam) или небольших субъединиц R2 и p53R2 (Santa Cruz). Значительных изменений в уровнях экспрессии RNR не обнаружено.

Анализ pSAMHD1 на этапе 592. Два независимых донора MDM были исследованы на pSAMHD1 с помощью иммуноблот-анализа (20 мкг белка). Был определен весь SAMHD1, а GAPDH использовался как внутренний контроль загрузки.

Ингибирование Gencitabine Vpx-опосредованного dNTP увеличивается. МДМ предварительно обрабатывали в течение 2 ч с различной концентрацией гемцитабина, как показано на рисунках. Затем добавляли VLP и клетки помещали в инкубатор в течение 24 часов, после чего их обрабатывали для dNTP. Был проведен анализ dNTP на основе HIV-1 RT и данные для каждого метаболита: (A) dATP, (B) dGTP, (C) dCTP и (D) dTTP. Проведено одностороннее ANOVA и отмечены значительные различия (*, P <0,05; **, P <0,01 и ***, P <0,001). Анализ проводился для двух независимых доноров.

Параметры ВЭЖХ-МС для оптимизации инструмента. Каждый метаболит был приобретен у Sigma, а затем работал на HLPC-MS для оптимизации чтения. Затем для определения концентрации концентраций этих метаболитов в МДМ, обработанных Vpx + VLP и Vpx-VLPs, затем применяли настройку.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Вклад авторов

JAH и ST провели эксперименты. GML, SR, DK и RFS внесли концептуальный вклад в экспериментальный дизайн. JAH, GML и BK написал рукопись. FDG предоставили реагенты. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Мы хотели бы поблагодарить Вааку Даддачу и Лауру Нгуен за техническую помощь в анализе dNTP на основе ВИЧ-1 на основе RT. Мы также хотели бы поблагодарить Майкла Хиршмана и Мишель Дали за техническую помощь. Это исследование было поддержано NIH AI049781 (B.K.), GM104198 (B.K.), 5P30-AI-50409 Emory Centers for AIDS Research (CFAR), AI087390 (F. D-G) и Департаментом по делам ветеранов.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *