Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Пассивная иммунизация против ВИЧ / СПИДа путем передачи гена антитела

Passive Immunization against HIV/AIDS by Antibody Gene Transfer
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3939464/

Несмотря на огромные усилия в течение многих лет, поиск эффективной вакцины против ВИЧ по классическому методу активной иммунизации остается в значительной степени неуловимым. Однако два недавних исследования на мышах и макаках продемонстрировали новую стратегию, обозначенную как Vectored ImmunoProphylaxis (VIP), которая включает в себя пассивную иммунизацию посредством вирусной векторной доставки генов, кодирующих широко нейтрализующие антитела (bnAbs) для экспрессии in vivo. Прочная защита от вирусной инфекции наблюдалась в доклинических условиях, когда животным давали VIP для экспрессии моноклональных нейтрализующих антител. Этот неортодоксальный подход открывает новые перспективы для борьбы с продолжающейся глобальной пандемией ВИЧ. В этой статье мы рассмотрим состояние передачи гена антител, рассмотрим революционный прогресс в изоляции чрезвычайно bnAbs, подробно рассмотрим VIP-эксперименты против ВИЧ и связанного с ним вируса у гуманизированных мышей и макакских обезьян и обсудим плюсы и минусы VIP и его возможности и проблемы в отношении клинических применений для борьбы с эндемиками ВИЧ / СПИДа.

С момента появления синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) более 30 лет назад более 25 миллионов человек умерли от СПИДа, а около 34,2 миллиона были инфицированы вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусом, вызывающим СПИД [1,2 ]. Болезнь оказывает непропорционально большее влияние на слаборазвитые районы мира, где СПИД разрушил целые страны, особенно в Африке, убивая как взрослых, так и детей, и резко сокращает ожидаемую продолжительность жизни и экономический рост. Хотя развитие антиретровирусной терапии на основе лекарств (АРТ) замедлило или даже остановило прогрессирование СПИДа, оно не может излечить болезнь; в большинстве случаев ВИЧ-инфицированные лица, оставшиеся без лечения, не выживают. Эта пожизненная зависимость от лекарственной терапии вызывает серьезную обеспокоенность в отношении устойчивости и доступности АРТ и представляет собой сложные глобальные экономические и медицинские проблемы [2].

Широко признано, что наиболее эффективным методом остановить или замедлить эпидемию СПИДа является безопасная и эффективная вакцина [3,4,5]. К сожалению, несмотря на почти 30 лет интенсивных научных исследований, эффективная вакцина против ВИЧ / СПИДа не подходит к лицензированию. Чтобы объяснить такую ​​неудачу, ученые указали на уникальные свойства, которые ВИЧ развил, чтобы уклониться от иммунного распознавания [6,7]. Накопление данных, полученных другими вирусами и исследованиями на животных, связанных с ВИЧ, указывает на необходимость получения нейтрализующих антител (nAbs), вызванных вакциной, в качестве наиболее эффективной защиты от ВИЧ-инфекции [8,9,10,11,12,13,14,15,16 ]. Однако ВИЧ — это окутанный ретровирус, который представляет проблемы для традиционных стратегий вакцины на основе nAb. Вирус мутирует быстро, чтобы изменить его поверхностную структуру, использует неиммуногенные гликаны, полученные хозяином, для маскировки его открытой поверхности и скрывает его консервативные и потенциально уязвимые области, такие как сайт связывания CD4 в интерфейсах олигомерных белков [6,17]. Несмотря на то, что 20% хронически инфицированных ВИЧ-инфицированных людей имели nAbs и 2% -4% из них имели широко нейтрализующие антитела (bnAbs), способные нейтрализовать большинство тестируемых штаммов ВИЧ [18], эти антитела производятся только через несколько месяцев до нескольких лет вирусной инфекции [ 1]. Задача заключается в определении вакцинных препаратов и способов доставки для выявления антител, предпочтительно nAbs, для защиты людей от инфекции при воздействии ВИЧ.

В качестве альтернативы традиционным вакцинным методам недавние исследования у мышей [19] и обезьян [20] продемонстрировали подход генной терапии для создания вакциноподобной защиты путем доставки генов, кодирующих nAbs, в негемопоэтические ткани, такие как мышцы [21,22,23] , Эта новая стратегия называется Vectored ImmunoProphylaxis (VIP) (рис. 1). Преимущество этого подхода заключается в прямом обеспечении nAbs через трансгенную экспрессию в клетках-хозяевах, минуя зависимость от естественной иммунной системы для установки желаемых гуморальных иммунных ответов. VIP расширяет применение моноклональных антител (mAbs) от пассивной иммунизации до новой формы генной терапии, которая основана на передаче генов антител и их последующей экспрессии в тканях хозяина. В этой статье мы рассмотрим перенос генов на основе антител и недавнюю разработку ВИЧ-специфических bnAbs, а затем обсудим плюсы и минусы VIP и его возможности и проблемы в отношении клинических применений для борьбы с эндемиками ВИЧ / СПИДа.

Схематическое изображение векторного иммунопрофилактики (ВИП) на основе вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), основанного на Адено-ассоциированном вирусе (AAV).

С 1986 года Управление по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) до настоящего времени одобрило около 30 моноклональных антител (mAbs) в качестве терапевтических препаратов для лечения больных раком и аутоиммунных, воспалительных и инфекционных заболеваний [24,25]. Еще много перспективных mAb находятся в доклиническом и клиническом развитии. Таким образом, терапевтические антитела стали наиболее быстрорастущим классом терапевтических молекул в фармацевтической промышленности [26,27,28]. Антитела терапия обычно включает высокие дозы в течение длительного периода времени, тем самым требуя больших количеств реагентов клинического класса для лечения одного пациента, и, тем не менее, mAb являются одними из самых сложных и дорогих фармацевтических продуктов для производства [29,30,31,32, 33]. Поэтому разработка надежных производственных процессов для производства индивидуальных mAb с высокой производительностью и выходом остается узким местом для быстрой доставки терапевтических преимуществ пациентам. Чтобы преодолеть этот барьер, альтернативный подход включал бы сам организм в завершение производства антител. Действительно, мириады доклинических исследований показали, что производство антител in vivo после переноса гена является возможным и что оно может потенциально ускорить перевод терапевтических mAb из скамьи в постель.

Ключевым этапом переноса гена антитела является идентификация подходящих векторов доставки для эффективного доставки генов антител в ткани хозяина для экспрессии in vivo. Невирусная доставка путем электропорации обнаженной ДНК в мышечные клетки изучалась для передачи in vivo генов, кодирующих mAb [34,35,36,37]. Концентрации плазменных антител 0,4-1,5 мкг / мл наблюдались у мышей и овец в течение 6-7 месяцев. Это подтвердило, что клетки скелетных мышц обладают клеточными факторами, необходимыми для синтеза антител, и что высоковаскуляризованная мышца может переносить полученные антитела в системный кровоток. Хотя невирусные векторы легко продуцируются и не индуцируют специфичные для вектора иммунные ответы [38], эффективность переноса низкая, что приводит к минимальному выработке антител, что может оказаться неприемлемым для терапии.

Исходя из их более высокой эффективности трансдукции, различные вирусные векторы были протестированы на перенос гена антитела in vivo. Внутривенное введение аденовирусных векторов (рекламы) мышам показало долгосрочные средние концентрации антител в сыворотке в диапазоне от 0,02 мкг / мл до> 40 мкг / мл с пиковыми концентрациями до 1 мг / мл [39,40,41] , В этих экспериментах использовался наиболее хорошо изученный вектор, полученный из серотипа 5 аденовируса человека (Ad5). Высокое трансгенное выражение обычно происходит в печени, легких и селезенке для этого вектора после инъекции хвостовой вены у мышей. Производство антител можно было обнаружить уже в первый день и достигнуть максимума в дни 3-6 после введения, после чего выражение довольно быстро уменьшалось [41]. В дополнение к его временной экспрессии, которая не подходит для терапии антителом, требующей длительной доставки, клиническое использование рекламы затруднено воспалительным и иммунным ответом, который они вызывали после введения in vivo [38,42,43]. Многие исследования генной терапии на основе Ad пришли к выводу, что эта векторная система может быть лучше всего подходит для приложений, которые нуждаются только в временной экспрессии и что иммунная стимуляция желательна, например, генетическая вакцинация и терапия рака. [44].

Адено-ассоциированные вирусные векторы (AAV), хотя и не интегрированы в геном, могут трансформировать нереплицирующие и долгоживущие клетки in vivo, и полученное выражение может сохраняться в течение месяцев до нескольких лет в их ассоциированных тканях [38,44]. Это также указывает на то, что антивекторный иммунитет, индуцируемый AAV, находится на управляемом уровне [45], так что клетки, модифицированные вектором, могут долго выживать из иммунной системы. Таким образом, различные серотипы AAV стали наиболее привлекательными векторами генной терапии in vivo [46], и многие из них продемонстрировали многообещающие результаты в ранних фазовых клинических испытаниях [47,48,49,50,51,52,53, 54,55,56,57,58]. Задача для AAV в качестве транспортных средств доставки — их ограниченная упаковочная способность. Поэтому, поскольку AAV не могут помещать обычную кассету экспрессии антител с тяжелой и легкой цепями при двух отдельных промоторах или с тяжелыми и легкими цепями под одним промотором, но связаны последовательностью ДНК для внутреннего места входа рибосомы (IRES). Кларк и коллеги создали двойной промотор AAV2 для экспрессии антитела IgG1b12 [59]. Хотя вектор мог быть получен, его титр был скомпрометирован из-за большой вставки ДНК, которая достигла предела упаковки AAV2. В качестве компенсаторного метода той же группе пришлось разработать иммуноадгезиновую форму антителоподобных молекул, которая имеет более короткие последовательности для эффективной упаковки и производства высококачественных AAV [20]. Тем не менее, этот упаковочный барьер теперь преодолевается изящным подходом, в котором обнаружена последовательность самообразования 2А (F2A, длиной всего 72 пары оснований), с помощью расщепления фурина сайт. После размещения между тяжелыми и легкими цепями эффективная экспрессия антител с помощью AAV активируется из одной рамки считывания, приводимой одним промотором [60]. Введение in vivo AAV8 (4 × 1011 геномных копий (gc)) с этой конфигурацией FMDV 2A через венную венную вену приводило к среднему сывороточному антителу ~ 1 мг / мл в течение 4 месяцев с максимальной концентрацией до 8 мг / мл. Эта работа вдохновила еще много исследований на различные серотипы AAV, вводимые внутривенным [61], интраназальным [62], интравитреальным [63], внутриплевральным [64] или внутримышечным [19] маршрутами экспрессии in vivo антител. Эти исследования последовательно демонстрировали высокую продукцию антител титра в течение длительного периода времени. Таким образом, кажется, что AAV являются наиболее благоприятными векторами доставки для достижения долговременной и эффективной экспрессии антител in vivo. Следует отметить, что экспрессия AAV-опосредованного антитела обычно занимает две недели, чтобы достичь значительного уровня [65], что предотвращает его применение в ситуациях, требующих немедленной доставки антител. В свете различной кинетики экспрессии антител, опосредуемой Ads (быстрая, но короткая, от 1 дня до 4 недель) и AAV (медленная, но продолжительная, от двух недель до нескольких лет), Бойер и коллеги продемонстрировали, что совместное администрирование Ad и AAV векторы эффективно приводят к быстрой и устойчивой доставке антител in vivo [65].

Пассивная иммунизация терапевтическими mAb уже предоставила терапевтические преимущества для больных раком [25]. После этого успеха перенос гена антител тестировался в различных доклинических опухолевых моделях [66, 67]. Основываясь на своей новаторской стратегии использования 2A для связывания тяжелых и легких цепей антител, Jooss и соавторы сообщили о значительном замедлении роста опухоли после внутривенной инъекции AAV8, кодирующего антитело против VEGFR2 как в мышиной меланоме, так и в моделях глиомы человека [60]. Цянь и его коллеги оценивали внутривенную доставку трастузумаба Ad5, и обнаружили, что такое лечение может привести к значительной ликвидации рака яичников у мышей [40]. Та же группа также вводила Ad5-векторы, кодирующие Rituxan-версию анти-CD20-антитела, и наблюдала продуцирование> 40 мкг / мл антител в сыворотке, что позволило полностью исключить трансплантированную В-клеточную лимфому у голых мышей [68]. В модели опухоли ксенотрансплантата A431 Гермистон и его коллеги смогли продемонстрировать значительное ингибирование роста опухоли, когда анти-EGFR-антитело, экспрессирующее AAV1, вводили внутримышечно как в профилактических, так и в терапевтических условиях [69]. Когда лентивирусный вектор (LV) применяли для доставки анти-Met-антител через внутривенный или внутриутробный путь, Комоглио и коллеги сообщили о значительном ингибировании опухоли в модели ксенотрансплантата колоректальной карциномы человека. Используя аналогичный вектор LV, Чжэн и коллеги показали, что опосредованная вектором передача антитела против DR5 посредством внутримышечного введения продлевала продолжительность жизни мышей, инокулированных ортотопическими опухолевыми клетками легких человека [70]. Таким образом, в дополнение к Ad и AAV-векторам эти два исследования также предполагают, что система LV может быть использована для вирусной векторной опосредованной доставки антител in vivo.

Эффективность передачи гена антитела также оценивалась при инфекционных заболеваниях. В дополнение к ВИЧ, о котором говорится ниже, генетическая доставка антитела использовалась для профилактики и / или лечения инфекций, вызванных респираторно-синцитиальным вирусом (RSV), бактериями Yersinia pestis и сибирской язвой и вирусом гриппа. Воргал и коллеги построили серотип Ad5 и нечеловеческий серотип Ad5 и non-human rh.10 AAV (AAVrh.10), кодирующий паливизумаб, антитело против RSV, которое было клинически одобрено для предотвращения инфицирования RSV в группах высокого риска [71,72,73] , и проверили их способность предотвращать инфекцию RSV у мышей [64]. В то время как внутривенная инъекция Ad5 могла уменьшить инфекцию RSV, по меньшей мере, в 5,4 раза, интраплевральная инъекция AAVrh.10 была превосходной, способной улучшать инфекцию с титрами RSV в 10,6-14,3 раза. В результате летального испытания Yersinia pestis у мышей Бойер и его коллеги смогли защитить 80% животных от инфекции после введения Ad5-кодирующего антитела против V-антигена Yersinia pestis [41]. В эксперименте по проблеме токсина сибирской язвы у мышей одна и та же исследовательская группа продемонстрировала двухкомпонентный способ доставки путем совместного введения векторов Ad5 и AAVrh.10, чтобы обеспечить как немедленную (по Ad5), так и долговечную (по AAVrh.10) защиту [65 ], что может иметь важное значение для приложений против агентов биообработки / биотерроризма [74]. Чиба и коллеги оценивали доставку голой ДНК на основе электропорации, кодирующей антитело против гемагглютинина, и обнаружили, что продуцируемые антитела были достаточными для защиты мышей от летального вируса гриппа, несмотря на его относительно временную экспрессию [37]. Впоследствии Балтимор и коллеги продемонстрировали, что внутримышечное введение AAV8, кодирующего широко нейтрализующие антитела, может защитить мышей от инфекции различными штаммами гриппа H1N1 [75]. Кроме того, Уилсон и его коллеги показали, что интраназальная доставка AAV9, содержащая другое широко нейтрализующее антитело, может обеспечить широкую защиту от клинических изолятов вирусов гриппа H5N1 и H1N1 у мышей и хорьков [62].

Для решения проблемы кокаиновой зависимости Кристалл и сотрудники внутривенно вводили AAVrh.10, экспрессируя антитело против кокаина на мышах, и обнаружили, что продуцируемое антитело было достаточным для секвестрации внутривенно вводимого кокаина в крови [76]. Следовательно, обработанные животные были полностью устойчивы к кокаину. Когда антитело против никотина было сконструировано в AAVrh.10, одна и та же команда продемонстрировала, что инъекция вектора давала специфичные для никотина антитела, способные защищать мозг от системно вводимого никотина, в результате чего отсутствовали физиологические эффекты никотина у обработанных мышей [61 ]. Эти исследования расширили применение переноса гена антител от рака и инфекционных заболеваний к нарушениям зависимости, демонстрируя широкую полезность этого метода.

Для всех доступных человеческих и ветеринарных вакцин против инфекционных вирусов уровень сыворотки nAbs тесно коррелирует со степенью защиты [8]. Механизм нейтрализации nAbs заключается в блокировании взаимодействия вирусных оболочек с их рецепторами или ингибировании вирусов для их дальнейшего переноса в цитоплазму [77, 78]. Установочные данные свидетельствуют о том, что нейтрализация на основе антител также жизненно важна для защиты от ВИЧ [9,10,11,12,13,14,15,16], хотя антителозависимая цитотоксичность (ADCC) и антителозависимое клеточно-опосредованное ингибирование вируса ( ADCVI) могут играть роль в пресечении вирусной нагрузки путем контроля более поздней фазы репликации вируса [79]. Поскольку у ВИЧ есть много возможностей уклониться от гуморальных иммунных реакций, многие трудности возникли в предыдущие годы в изоляции bnAbs. До 2009 года у нас было только ограниченное число так называемых «bnAbs первого поколения против ВИЧ» [6,78,80]. Однако с 2009 года были достигнуты прорывы, и была выявлена ​​большая группа «bnAbs второго поколения против ВИЧ». Эти bnAbs обладают большей эффективностью и широтой нейтрализации [78,81], и все они являются прекрасными ресурсами для передачи гена антител к ВИЧ-инфекции.

Первым широко нейтрализующим человеком Ab против ВИЧ является b12, который был выделен из инфицированного кланом B-инфицированного пациента путем скрининга фагов библиотек тяжелых и легких цепей [82]. Из-за этого метода изоляции неизвестно, является ли это естественным анти-ВИЧ-антителом. Было показано, что b12 может распознать сайт связывания CD4 (CD4bs) на поверхности gp120 оболочки ВИЧ (Env) [83] и может нейтрализовать почти 50% вирусных штаммов кладеина B и 30% неклапанных B-штаммов [84 , 85]. Другим сохраненным уязвимым сайтом на gp120 ВИЧ Env является олигомерная структура гликана на поверхности, покрытой углеводами gp120. Было определено, что один bnAb, 2G12 связывается с этим гликановым эпитопом и может нейтрализовать многие вирусные штаммы, полученные из кладинного B [86,87]. После того, как Env связывает его рецептор CD4, он вызывает изменения конформации в форме и отображает CD4-индуцированный (CD4i) эпитоп, что позволяет развить ВИЧ-специфические mAb [88]. Хотя этот CD4i-эпитоп очень консервативен среди разных клад, изолированные mAb, такие как 17b, обладают только слабой реакцией нейтрализации, и их потенцию можно повысить только при использовании низких концентраций растворимых CD4 (CD4) или использовать форму Fab 17b в анализе нейтрализации [89]. Кроме того, одна область на gp41 ВИЧ Env, называемая проксимальной внешней областью мембраны (MPER), была продемонстрирована в качестве хорошей мишени для ВИЧ-специфических nAbs. 2F5 и 4E10 являются двумя наиболее изученными bnAbs, которые связывают как MPG gp41, так и его близлежащие липиды [90,91]. Один из них, 4E10, демонстрирует впечатляющую широту нейтрализации по нескольким кладам, хотя он имеет слабую и умеренную потенцию [92]. Таким образом, несмотря на многолетнее обучение (с 1994 по 2008 год), лишь немногие bnAbs (b12, 2G12, 2F5, 4E10) до сих пор были идентифицированы как ВИЧ-специфические nAbs первого поколения, способные распознавать три определенных эпителия нейтрализации : CD4bs, гликановый домен и MPER [93].

В двух основных документах, опубликованных в 2009 году, был установлен новый курс по обнаружению bnAbs нового поколения против ВИЧ [94,95]. Чтобы объединить сортировку клеток gp140-связывающих B-клеток и одноцепочечное клонирование антител, Nussenzweig и сотрудники клонировали более 500 mAb, чтобы выявить, что множественные антитела, нацеленные на ряд эпитопов Env, способствуют широкой нейтрализующей серологической активности элитного нейтрализатора у пациентов, инфицированных ВИЧ [94]. Одновременно Бертон и коллеги использовали культуру клональных В-клеток для скрининга более чем 30 000 активированных клеток В-памяти от африканского донора, зараженного клад-А, и идентифицировали два мощных bnAbs, PG9 и PG16 [95], которые нацеливают контуры V1 / V2 gp120 [96]. Вскоре после этого был идентифицирован HJ16, bnAb, нацеленный на CD4bs, и способен нейтрализовать 40% вирусных изолятов [97]. Впоследствии конструкция антигенно повторных гликопротеинов с открытыми CD4bs привела к более успешной изоляции CD4bs-направленных bnAbs [98]. После скрининга нескольких сывороток, сортировка и одноклеточное клонирование выполнялись на В-клетках от донора с нейтрализующей реакционной способностью. Выделенный bnAb, VRC01 [98] может связываться с CD4bs [99] и нейтрализовать более 90% тестируемых штаммов ВИЧ [98, 100]. Основываясь на своей предыдущей работе [95], Бертон и коллеги отобрали ячейки памяти Б из четырех элитирующих нейтрализаторов и идентифицировали несколько гликано-зависимых bnAbs, обозначенных PGT121-PGT145 [101], некоторые из которых могут проникать в гликановый экран и распознавать эпитоп в окрестность области петли V3, а также два консервативных гликана на gp120 [102]. Дальнейшие исследования выделили существенно больше CD4bs-направленных bnAbs и улучшили наше понимание различных механизмов, используемых этими bnAbs, для заражения ВИЧ через этот CD4b [103,104]. Структурное исследование одного из этих bnAbs, NIH45-46, показало уникальный способ связывания, способствующий увеличению взаимодействия между антителом и gp120, и однократное замещение аминокислоты в этой области связывания ключей привело к варианту NIH-45-46G54W , с заметно увеличенной широтой и потенцией [105]. Более рациональные конструкции этого варианта дали мутант, 45-46 м2, который имеет большую ширину, а другой мутант 45-46 м7 способен ориентироваться на общий путь выхода ВИЧ [106]. Существенные успехи были также достигнуты в отношении MPER-специфических антител, и пример такого вновь идентифицированного bnAb, 10E8 мог бы нейтрализовать ~ 98% тестируемых штаммов вирусов и в то же время иметь мало недостатков, проявляемых предыдущими bnAbs (например, 4E10 и 2F5) в этой категории, такие как связывание липидов и аутореактивность [107]. Квонг и коллеги недавно предоставили самый обновленный и полный список этих ВИЧ-специфических bnAbs, объединив их в ключевые эпитопы распознавания: CD4bs, цикл V1 / V2, сайт glcan-V3 и MPER [81]. Открытие этих bnAbs не только трансформирует наше понимание гуморальных иммунных реакций против ВИЧ и облегчает разработку иммуногенов для выявления этих антител, но также позволяет исследователям тестировать стратегии борьбы с ВИЧ, которые зависят от пассивной иммунизации, передаваемой антителами или антителами -кодированные гены.

Несмотря на огромный успех в выявлении и характеристике bnAbs против ВИЧ, остается сложная проблема в разработке соответствующих форм иммуногенов для вызывания этих антител путем вакцинации [3,78,108]. Пассивная иммунизация путем вливания антител показала многообещающие результаты для защиты от ВИЧ-инфекции у макак-обезьян, но этот тип многолетнего повторного лечения является слишком дорогостоящим, что делает его нецелесообразным для широкого применения у людей. Таким образом, векторная иммунопрофилактика (VIP), которая включает одну инъекцию AAV для доставки in vivo генов, кодирующих bnAbs, является привлекательной альтернативой и обеспечивает непрерывную и устойчивую доставку антител для профилактики ВИЧ-инфекции. Два недавних исследования на животных моделях продемонстрировали, что VIP против ВИЧ является осуществимым [19,20], прокладывая путь для дальнейшего клинического тестирования у людей.

Для тестирования VIP против ВИЧ у мышей Балтимор и коллеги из Калифорнийского технологического института создали векторы AAV8, кодирующие полноразмерный один из bnAbs (b12, 2G12, 4E10, 2F5 и VRC01) [19]. В экспериментальном испытании было обнаружено, что однократная инъекция AAV8 может обеспечить получение пикового антитела в сыворотке на 6 неделе. Выражение в следующие недели уменьшилось в 2-3 раза, но затем стабильно поддерживалось на протяжении времени исследование (64 недели). Хотя долгосрочное выражение было обнадеживающим, титр антител 4E10 в сыворотке является умеренным (~ 5 мкг / мл) и, следовательно, может оказаться недостаточным для защиты от ВИЧ. Была проведена серия оптимизаций для разработки улучшенной конфигурации экспрессии антител в мышцах. После тестирования нескольких промоторов авторы создали новый гибридный промотор, обозначенный CASI, который объединил энхансер непосредственного раннего промотора цитомегаловируса (CMV), промотора β-актина и усилителя промотора ubiquitin C (UBC), фланкированного сплайсингами донора и акцептора. Анализ экспрессии in vivo подтвердил, что CASI лучше, чем обычные тестируемые промоторы. Включение посттрансляционного регуляторного элемента вируса гепатита (WPRE) [109] улучшило экспрессию люциферазы in vivo почти в 10 раз. Авторы также оптимизировали конфигурацию трансгенного антитела путем оптимизации кодонов F2A, заменяя эндогенные сигнальные последовательности оптимизированными по кодону последовательностями, полученными из гормона роста человека, и устраняли потенциал неуместных последовательностей сращивания [110]. Конечный оптимизированный вектор AAV8 может опосредовать in vivo доставку антитела b12 на уровне, который был в 100 раз выше, чем у неоптимизированного вектора после одной инъекции икроножной мышцы [19].

При использовании оптимального вектора авторы вводили иммунодефицитные мыши (NOD / SCID / γc штамм или NSG) с помощью bAA-кодированного AAV8. Когда достигалось стабильное образование антител (6 недель), мышей NSG трансплантировали мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС). После приживления в течение 2 недель мышам было предложено внутривенную инъекцию штамма ВИЧ NL4-3 и контролировали степень истощения CD4 и уровень ВИЧ p24 в тканях. Среди bnAbs первого поколения b12 (более 100 мкг / мл) было единственным антителом, которое обеспечивало полную защиту, тогда как 2G12 (~ 250 мкг / мл), 4E10 (~ 25 мкг / мл) и 2F5 (~ 25 мкг / мл) обеспечивали частичную защиту. Фактически AAV8-опосредованная экспрессия b12 была настолько мощной, что она могла защитить от заражения ВИЧ при дозах (125 нг) в 100 раз выше, чем необходимо для истощения CD4-T-клеток у контрольных животных без экспрессии b12. Авторы также опробовали доставку bnAb второго поколения VRC01 по AAV8 на той же модели для животных и сравнили ее эффективность с b12. Хотя их экспрессия была сходной, VRC01 может обеспечить полную защиту от заражения ВИЧ (10 нг) при титрах 8,3 мкг / мл, тогда как более высокий титр b12 (34 мкг / мл) необходим для равной защиты, демонстрируя in vivo, что VRC01 является превосходным антителом к ​​AAV-опосредованному переносу генов для борьбы с ВИЧ.

Со времени публикации этой работы команда Балтимора провела больше экспериментов, а некоторые из последних результатов были представлены на спутниковом симпозиуме на конференции по вакцине против СПИДа 2012 года [23]. Большинство человеческих инфекций ВИЧ проходят через поверхность слизистой оболочки; следовательно, ВИЧ необходимо транспортировать по многим барьерам слизистой оболочки для успешной инфекции [111]. Новые исследования показали, что первоначальная инфекция обычно включает только одну или несколько вирусов-основателей [112,113,114]. Балтимор и его коллеги выполняли VIP для мышей, чтобы выразить b12 или VRC01, а затем внутривенную заражение ВИЧ с помощью штамма-основателя REJO.c. Было отмечено, что VRC01, но не b12, может обеспечить существенную защиту. Это исследование не только подтверждает превосходство VRC01, но также демонстрирует, что (1) основанные вирусы не устойчивы к нейтрализации и (2) новое поколение bnAbs может нейтрализовать их in vivo. Чтобы более точно моделировать передачу ВИЧ-инфекции у людей, группа Балтимора адаптировала гуманизированную мышь BLT (костный мозг-печень-тимус химер) для VIP-тестирования, в которой может быть реализована низкая доза, интравагинальная проблема ВИЧ. Мыши BLT были очень устойчивы к интравагинальной проблеме лабораторного штамма HIV, JR-CSF, после того, как мышам дали VIP, чтобы выразить VRC01 или сконструированное, более мощное VRC01-подобное антитело, VRC07G54W. Несмотря на 15 повторных воздействий на вирус, у 5 из 8 мышей, экспрессирующих VRC01, и у 12 из 12 экспрессирующих VRC07G54W мышей не было обнаруженного уровня ВИЧ. Для двух инфицированных мышей инфекция происходила на более поздней стадии повторяющейся проблемы. Более поразительные результаты наблюдались, когда штамм основанного на REJO.c штамма использовали для интравагинальной инфицирования мышей, получавших VIP, для выражения VRC07G54W. Все мыши были защищены без обнаруживаемой вирусной нагрузки с помощью анализа вирусной нагрузки на основе ПЦР. Эта серия экспериментов с мышами BLT демонстрирует, что VIP может обеспечить защиту от передачи ВИЧ через слизистую оболочку, и что VIP может обеспечить доставку не только натуральных антител, но также разработанных антител, таких как VRC07G54W.

До работы команды Балтимора Джонсон и сотрудники Детской больницы Филадельфии продемонстрировали концепцию VIP против вируса иммунодефицита обезьян (SIV), эквивалентного ВИЧ-инфекции у людей, у макак-обезьян [20]. Без оптимального вектора, созданного командой Балтимора, команда Джонсона использовала самодополнительные векторы AAV (scAAV) с двухцепочечными геномами для лучшей экспрессии белка in vivo [115]. Однако компромисс scAAV является уменьшенной кодирующей способностью для трансгенов, что делает невозможным перенос полноразмерных генов антител. Таким образом, молекула-конструктор, называемая иммуноадгезином, которая имеет более короткую последовательность, чем полное антитело, была выбрана в качестве антителоподобного белка в исследовании [20]. Разработанный анти-SIV иммуноадгезин состоял из одноцепочечного антитела (scFv), слитого с частью Fc константных доменов иммуноглобулина. В исследовании основное внимание уделялось двум иммуноадгезинам, 4L6 и 5L7, а также иммуноадгезину (N4), который scFv был заменен связывающим доменом резуса CD4.

Каждая когорта из трех обезьян вводилась внутримышечно либо серотипом 1 scAAV (scAAV1) для доставки 4L6 и 5L7, либо серотипом 1 обычного одноцепочечного AAV (AAV1) в дозе 2 × 1013 gc. Обезьяны, которым дали VIP для выражения 4L6, показали впечатляющую продукцию антител, которая достигала 100-190 мкг / мл через 4 недели после инъекции, достигла максимума в 4-6 месяцев и затем поддерживалась выше 200 мкг / мл. В когорте 5L7 наблюдалась большая вариация, в которой две обезьяны имели сыворотку иммуноадгезином 40 мкг / мл и 175 мкг / мл на 4-й неделе после инъекции, в то время как у одной обезьяны было 50 мкг / мл иммуноадгезина через 2 недели, но они потеряли его выражение на 4-й неделе после инъекции. Когорта N4 имела значительно меньшую концентрацию иммуноадгезинов в сыворотке, предположительно из нижней опоры, опосредованной вектором, одноцепочечным AAV1. Все обезьяны были подвергнуты внутривенному вмешательству с помощью SIV на 4-й неделе после инъекции. Примечательно, что полная защита наблюдалась во всей когорте 4L6, одной обезьяны в когорте 5L7 и двух обезьян в когорте N4. Дальнейший анализ показал, что потеря экспрессии 5L7 у одной обезьяны была вызвана генерацией иммуноадгезинспецифических ответов на антитела, что могло бы облегчить клиренс трансген-экспрессирующих клеток. Эти ответы на трансген-специфические антитела были также обнаружены у двух других обезьян, один из когорты 5L7 и один из когорты N4, хотя и на гораздо более низком уровне. Анализ корреляции защиты показал, что VIP защищает только обезьяны без детектируемых ответов антител против иммуноадгезина. Тем не менее, исследование команды Johnson показывает, что VIP может обеспечить надежную защиту от вирусной инфекции, если иммунные реакции против трансгенов контролируются соответствующим образом. В нем также подчеркивается превосходство архитектуры естественных антител, которая должна иметь более низкие иммунные ответы по сравнению с белками, не являющимися самостоятельными, такими как иммуноадгезин.

На том же спутниковом симпозиуме на конференции по вакцине против СПИДа 2012 д-р Джонсон объяснил, как его работа продвигалась со времени его последней публикации. Он показал, что обезьяны, которым дали VIP, чтобы выразить иммуноадгезин 4L6, могли поддерживать стабильную экспрессию с концентрацией сыворотки ~ 20 мкг / мл в течение более 5 лет. Этот результат согласуется с другим предыдущим исследованием, в котором внутримышечная инъекция AAV1 могла поддерживать экспрессию белка эритропоэтина у обезьян более 6 лет [116]. Это захватывающая новость, потому что это означает, что долгосрочная защита VIP возможна у приматов. Джонсон также поделился результатом сравнения нейтрализующей активности полной антитела против иммуноадгезиновых форм PG9. Полная архитектура антител имела эффективность нейтрализации, которая была в 10 раз больше, чем у иммуноадгезина, что подтверждает предыдущий отчет в аналогичном исследовании [117]. Из-за потенции и иммуногенности доктор Джонсон заключил на совещании, что естественная архитектура антител является предпочтительной для будущих VIP-тестов у людей [23].

Учитывая, что поиск эффективной вакцины с помощью активной иммунизации остается неуловимым, неортодоксальные подходы, такие как VIP путем передачи генов антител, могут поднять новые надежды в борьбе с продолжающейся глобальной пандемией ВИЧ. Исследования, изучающие VIP как новый способ профилактики ВИЧ у мышей и макак, показывают обнадеживающие результаты. Поскольку концепция была продемонстрирована и доклинические эксперименты были завершены, следующим препятствием является оценка такого подхода у людей. Действительно, два этапа испытаний фазы I находятся на стадии планирования для тестирования VIP, получаемого путем внутримышечного введения кодирующих антител AAV [23]. Судебное разбирательство, проведенное доктором Джонсоном и его коллегами, заключается в использовании AAV1 для доставки антитела PG9 к высокочувствительным, серонегативным добровольцам. Были завершены обсуждения с УЛХ США для пробного плана, и был создан вектор клинического класса. Ожидается, что испытание начнется в конце 2013 года или в начале 2014 года. В сотрудничестве с Исследовательским центром по вакцинам и Национальными институтами здравоохранения США команда Baltimore планирует провести клиническое испытание для тестирования VIP посредством AAV8-опосредованной доставки VRC01 антитела через инъекцию мышц добровольцам, получающим лечение АРТ.

Поскольку мы с тревогой ожидаем результатов этих двух испытаний, мы также должны признать, что впереди еще несколько препятствий. Во-первых, мы не знаем, как доклинические результаты мышей и макак будут переведены на людей. Хотя макаки могут быть лучшими животными для моделирования ВИЧ, они могут быть инфицированы только SIV и SHIV (химерным вирусом обезболивающего / человеческого иммунодефицита) [118,119,120], а не ВИЧ напрямую. Таким образом, неясно, как результат экспериментальной экспериментальной модели вирусного теста, проводимой в макаках с учетом того, что VIP для выражения ВИЧ-специфических bnAbs может быть связан с истинным контролем ВИЧ у людей. Кажется, что человеческий процесс остается лучшим средством для определения успешных протоколов VIP, таких как дозы, места инъекции мышц и серотипы AAV. Во-вторых, поскольку VIP является формой генной терапии на основе AAV, он подвержен всем вопросам безопасности, связанным с этим типом генной терапии, таким как иммуногенность векторов AAV [45] и AAV-опосредованного инсерционного мутагенеза [121]. Это становится еще более важным, если учесть, что намерение VIP — обеспечить профилактику здоровых людей. Поощряюще, недавние исследования подтверждают несколько терапевтических успехов генной терапии на основе AAV для генетических заболеваний в клинических испытаниях [47,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58] и Glybra, которая включает в себя генетическая доставка липопротеиновой липазы (LPL) путем внутримышечной инъекции вектора AAV1 для лечения болезни LPL, была только что лицензирована в Европе [55]. Эти успехи облегчают некоторые проблемы безопасности и, безусловно, будут способствовать клиническому развитию VIP. Наконец, конститутивное выражение может индуцировать иммунные ответы против VIP-антитела и / или лиганда F2A, что, в свою очередь, может привести к снижению продукции антител и другим неизвестным эффектам. В качестве меры предосторожности может быть желательно разработать регулируемую систему экспрессии, такую ​​как система экспрессии гена, регулируемая димеризатором [116, 122, 123] для включения и выключения экспрессии антител.

Мы благодарим Дэвида Балтимора за критическое чтение этой рукописи. Мы также благодарим поддержку Фонда Билла и Мелинды Гейтс через гранты Гранд Гранты в Глобальной инициативе в области здравоохранения и участники команд из лаборатории Балтимора, лаборатории Бьоркмана и лаборатории Ванга, которые внесли свой вклад в работу в области инженерного иммунитета против ВИЧ / СПИД.

LY и PW написал, отредактировал рукопись. Оба автора прочли и утвердили окончательную рукопись.

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *