Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Анализ жесткости белковых биологических сборок и периодических кристаллических структур

Rigidity analysis of protein biological assemblies and periodic crystal structures
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3817814/

Мы инициируем теоретические исследования твердости силикона в отношении биологических сборок и небольших кристаллов для белковых структур. Цель состоит в том, чтобы определить, влияет ли взаимодействие между соседними клетками и подцепами на гибкость молекулы в ее кристаллизованном состоянии. Мы используем экспериментальные данные рентгеновской кристаллографии из банка данных о белках (PDB). Анализ основан на эффективном алгоритме на основе графов. Вычислительные эксперименты проводились с использованием новых инструментов анализа жесткости белков, доступных в новой версии нашего KINARI-Web-сервера http://kinari.cs.umass.edu.

Мы предоставляем два типа результатов: на биологических собраниях и на кристаллах. Мы обнаружили, что при рассмотрении только изолированных подцепей структурная и функциональная информация может быть пропущена. Действительно, жесткость биологических сборок иногда зависит от количества и размещения водородных связей и других взаимодействий между отдельными подцепами биологической единицы. Аналогично, на жесткость мелких кристаллов может влиять взаимодействие между атомами, принадлежащими к различным элементарным ячейкам.

Мы проанализировали набор данных из примерно 300 белков, из которых мы создали 982 кристалла (некоторые из которых являются биологическими ассамблями). Мы определили два типа поведения. (a) Некоторые кристаллы и / или биологические сборки будут объединяться в жесткие тела, которые охватывают несколько единичных ячеек / асимметричных единиц. Некоторые из них создают значительно более жесткий жесткий кластер в форме кристалла / биологической сборки, в то время как в других случаях агрегация оказывает меньший эффект только на границе раздела между единицами. (б) В других случаях жесткие свойства асимметричных единиц сохраняются, поскольку жесткие тела не объединяются.

Мы также выделили два интересных случая, когда анализ жесткости может быть соотнесен с функциональным поведением белка. Этот тип информации, идентифицированный здесь в первый раз, в решающей степени зависит от способности создавать кристаллы и биологические сборки и не наблюдался бы только из асимметричной единицы.

Для белка Ribonuclease A (PDB-файл 5RSA), который функционально активен в кристаллизованной форме, мы обнаружили, что индивидуальный белок и его кристаллическая форма сохраняют параметры гибкости между двумя состояниями. Напротив, производное Ribonuclease A (PDB-файл 9RSA) не имеет функциональной активности, а белок как в асимметричной, так и в кристаллической формах является очень жестким.

Для белка протеинов вируса коровьей оспы D13 (файл PDS 3SAQ), который имеет две биологические сборки, мы наблюдали поразительную асимметрию в разложении кластеров жесткости одного из них, что кажется неправдоподобным, учитывая его симметрию. После тщательного расследования мы отследили причину решения о размещении с помощью программного обеспечения Сокращения, касающегося атомов водорода, что повлияло на распределение определенных водородных связей. Неожиданный результат заключается в том, что присутствие или недостаток очень немногих, но критических водородных связей может резко повлиять на жесткое кластерное разложение биологической сборки.

Анализ жесткости одной асимметричной единицы может неточно отражать поведение белка в плотно упакованной кристаллической среде. Используя наше программное обеспечение KINARI, мы продемонстрировали, что дополнительную информацию о функциональности и жесткости можно получить, проанализировав биологическую сборку и / или кристаллическую структуру белка. Однако проведение крупномасштабного исследования было бы дорогостоящим вычислительным (из-за размера задействованных молекул). Преодоление этого ограничения потребует новых математических и вычислительных расширений для нашего программного обеспечения.

Белки являются неотъемлемой частью всех организмов. Некоторые из них имеют структурные функции, некоторые помогают смягчить ферментативные реакции; они задействованы практически во всех клеточных процессах. Белки состоят из длинных цепочек аминокислот, соединенных друг с другом, взаимодействие которых приводит к тому, что цепь складывается, образуя дополнительные вторичные, третичные и четвертичные структуры [1]. Функция белка часто коррелирует с конформационными изменениями, которые обусловлены молекулярными взаимодействиями. Чтобы лучше понять функцию белка, его движение можно моделировать и можно наблюдать критические химические взаимодействия между его составными частями. Однако такие симуляции являются вычислительно интенсивными и часто трудноразрешимыми. Альтернативным методом является моделирование белка как механической структуры, состоящей из жестких и гибких деталей. Общая жесткость такой структуры может быть проанализирована с использованием эффектного комбинаторного алгоритма, который описан ниже, и полученное разложение на жесткие кластеры дает представление о возможных движениях белка. Анализ ригидности показал свою полезность [2], давая представление о гибкости белков, но до сих пор такие исследования проводились только на небольшом наборе белков, каждый из которых принимался изолированно.

Более 87% белковых структур, депонированных в банке данных о белках, были решены с помощью рентгеновской кристаллографии. Кроме того, функция белка коррелирует с гибкостью, и можно было бы ожидать, что в плотно упакованных кристаллах также будет потеряна некоторая гибкость. Действительно, в работе, проделанной Чжан, et. al [3], анализ 25 кристаллических форм лизоцима T4 показал, что кристаллические контакты нарушают основную цепь белка на 0,2-0,5Å. Исследования гибкости белков с использованием анализа жесткости до настоящего времени выполнялись прежде всего на отдельных асимметричных единицах (наименьшей части белка, которая необходима для воссоздания биологической функциональной формы белка) из данных, доступных в PDB.

Для некоторых белков асимметричная единица идентична биологической сборке. Однако для многих белков, особенно тех, которые определены с помощью рентгеновской кристаллографии, асимметричная единица отличается от биологической сборки. В зависимости от того, как кристаллизуется белок, связь между асимметричной единицей и биологической сборкой может варьироваться от белка к белку. Некоторые биологические сборки состоят из множества копий асимметричной единицы.

Файл PDB содержит только атомные координаты асимметричной единицы, и естественно ожидать, что анализ его жесткости может не всегда отражать гибкие свойства биологической формы. Одним из крайних примеров является вирусный капсид: икосаэдрический тип состоит из 60 повторяющихся единиц, и каждый из них может содержать несколько мономерных единиц. Для получения информации о гибкости вируса потребуется построить всю сборку, но до сих пор ни одно существующее программное обеспечение не выполняет эту задачу автоматически.

В этой статье мы демонстрируем, что новое понимание гибкости белков можно получить, проведя анализ жесткости биологических сборок и кристаллических структур белка. Эти вычислительные эксперименты были выполнены с использованием внутренней реализации и новых инструментов, которые теперь доступны в новой версии нашего KINARI-Web-сервера http://kinari.cs.umass.edu, который опирается на эффективный алгоритм на основе графов. Для доказательства концепции мы включили некоторые свободно доступные сценарии для создания кристаллов. KINARI [4] поставляется с инструментами для обработки входных данных и для визуализации результатов жесткости. Чтобы исследовать жесткость биологических сборок, мы разработали и интегрировали с инструментом KINARI BioAssembly, который позволяет пользователю создавать биологические структуры из асимметричных единиц, обычно записанных в файлах PDB. Рисунок 1 (справа) показывает его выход жестких кластеров для небольшой кристаллической структуры белка 2ON8; разные цвета обозначают разные жесткие тела.

(слева) Мультяшный рендеринг асимметричной единицы файла PDB 2ON8 [29]; (в центре) небольшую кристаллическую структуру для 2ON8 и (справа) результаты ее гибкого анализа, полученные с использованием программного обеспечения KINARI. Различные цвета обозначают различные жесткие кластеры.

Мы протестировали наш метод на кристаллах 982 различных размеров, построенных из 324 файлов структуры белка, полученных из PDB. Мы обнаружили, что результаты жесткости различаются между различными белками, что указывает на то, что дополнительная информация может быть извлечена из анализа жесткости кристаллов и биологических сборок, а не только одной асимметричной единицы. В некоторых случаях биологическая единица, анализируемая изолированно, обладает значительно большей гибкостью, чем ее кристалл-контрагент, в то время как в других свойствах жесткости оказываются стабильными в двух формах.

Для этих 324 белков мы строим единичную ячейку, а также кристаллы 2x1x1 и 2x2x1 из данных асимметричной единицы в каждом файле PDB. Результаты жесткости были проанализированы с целью выявления тенденций в свойствах жесткости кристаллических решеток. Это указывало на то, что химические взаимодействия между отдельными белками в решетке могут сильно влиять на кристаллизованную форму белка. Однако некоторые кристаллические структуры не стабилизируются этими дополнительными химическими взаимодействиями, и это может отражать биологически значимое свойство. Действительно, в литературе [5] сообщается, что белок Ribonuclease A (RNase A) (код PDRS 5RSA) сохраняет свою функцию даже в кристаллизованной форме, используемой для определения его рентгеновской структуры. С другой стороны, производная белка RNase A (код PDRS 9RSA) сохраняет только 1% своей активности, и наш анализ показал, что он очень жесткий как в асимметричной форме, так и в кристаллической решетке. Результаты жесткости этих двух форм РНКазы А на удивление точно коррелируют с их сообщенными действиями.

Ниже мы опишем теоретические основы нашего метода, вычислительные эксперименты, подробные тематические исследования для нескольких кристаллических структур и биологических сборок и наш обзор свойств жесткости кристалла 982. В заключение мы обсудим будущую работу.

Геометрические и комбинаторные методы из теории жесткости были применены к изучению гибкости белка, связывая сеть узлов (атомов), связанных жесткими стержнями (связи и другие стабилизирующие взаимодействия). Изучение жесткости и гибкости этих бар-и-совместных каркасов восходит к правилу подсчета, идентифицированному в 1864 г. Я. Максвелл [6]. Расширение на 3-мерные структуры, известные как каркасы кузова и тела, было доказано Тай [7] и привело к эффектным алгоритмам [8,9] для анализа жесткости. Этот метод был применен для понимания гибкости стекол, белков [2] и других молекулярных структур.

В молекуле, моделируемой как каркас шарнира тела, тело представляет собой набор атомов, жестко связанных друг с другом. Например, метан (рис. 2, две левые субфигуры) является жестким, так как все парные расстояния между атомами в этой небольшой молекуле определяются существующими ковалентными связями длиной и углами. Этан (рис. 2, центр) проявляет одну степень гибкости, поскольку связь C-C позволяет вращать. Вращающиеся связи моделируются как шарниры. Две пептидные единицы на белковой цепи (рис. 2, две правые субфигуры) приводят к трем жестким телам, соединенным двумя петлями.

Метан (два левых изображения) является жестким, поскольку все парные расстояния между атомами фиксированы. В этане (в центре) атом углерода (серый) и его связанные соседние атомы образуют твердое тело. Два тела имеют шарнир вдоль центральной связи C-C, показанный как абстрактный каркас с шарниром корпуса (второй справа). Пептидные единицы белка моделируются как жесткие тела (далеко справа).

Так как методы анализа жесткости белков продвинулись, анализ жесткости был успешно использован для исследования и изучения структурных и функциональных аспектов различных молекул. Было обнаружено, что активные сайты ферментов имеют тенденцию быть более жесткими, чем другие области [10]. Rader et al. [11] измерили увеличение гибкости белков после термической денатурации; они предложили, чтобы сгиб белков в их трехмерную структуру рассматривался как процесс повышения жесткости и проверял его на белок Rhodopsin. Анализ жесткости белков в первую очередь применялся к единичным белкам, хотя биомолекулы и крупные макромолекулярные комплексы были в центре внимания хотя бы одного недавнего исследования [12]. Однако более крупные кристаллические структуры не были предметом анализа жесткости до этой работы.

Белки, используемые в этом исследовании, были получены из PDB, хранилища данных экспериментальной структуры белка с более чем 82 000 записей в это время. Файл PDB содержит координаты атомов для асимметричной единицы белка, т. Е. Минимальный набор атомов, необходимый для воспроизведения полной белковой биологической сборки и кристалла, который анализировали с помощью рентгеновской дифракции. Файл PDB содержит информацию о том, как создать биомолекулу, функциональную биологическую единицу и элементарную ячейку, повторяющуюся единицу кристалла. Вектор элементарной ячейки представляет собой вектор от начала координат к решетчатой ​​точке кристалла [13]. Для описания элементарной ячейки необходимы три элементарных вектора. Операция симметрии представляет собой операцию преобразования (представленную как матрицу), действующую на белок, который создает его копию, возможно, переведенную и повернутую. Группа пространств, упомянутая в файле PDB, представляет собой комбинацию операций симметрии и решетки, заданной векторами элементарной ячейки.

Чтобы генерировать биологическую композиционную форму белка, асимметричная единица в файле PDB должна быть повернута, скопирована, переведена и т. Д. Количество асимметричных единиц, составляющих биологическую сборку, варьируется от белка к белку. В некотором случае асимметричная единица является биологической формой, а в других — двумя, тремя или многими более асимметричными единицами, расположенными однозначно по отношению друг к другу, образуют биологическую сборку. Матрица преобразования в файле PDB указывает, как цепочка (и) в асимметричной единице должна обрабатываться для формирования биологической формы белка.

Для целей анализа жесткости может быть полезно создание только частей биологической сборки. Например, анализ все более значительных частей биологической сборки может дать представление об эволюции ее гибкости, поскольку она накапливается из ее компонентов субъединицы или разлагается на ее меньшие субъединицы. С вычислительной точки зрения создание PDB-файла для биологической единицы не всегда возможно в формате PDB, что и в настоящее время поддерживает KINARI. Действительно, этот формат может вмещать до 99,999 атомов и до 36 цепей, и многие крупные биологические единицы, такие как вирусы, легко превышают эти пределы.

Операции симметрии, решетки и пространственные группы, используемые для создания кристалла из асимметричной единицы, имеют свое основание в математической кристаллографии. Существует семь типов операций симметрии, каждая из которых имеет конкретное представление матрицы, но только три (вращение, перевод и вращение винта) допускаются в белках из-за хиральности; т. е. четыре операции симметрии не допускаются, поскольку они изменят ручность альфа-спирали белка [13] (рис. 3).

Три операции симметрии, разрешенные в белках из-за хиральности, — это Вращение (слева), Перевод (справа) и Вращение Винта (не показано). Эти операции не ставят под угрозу ручность альфа-спирали.

Матричные представления двух операций симметрии показаны на рисунке 4. Слева матрица, которая имеет только ± 1 значений на диагонали и нули в другом месте, преобразует исходные данные белка на 180 ° вращения и отражения вокруг одной из трех ортогональных осей. Справа показана общая структура матрицы преобразования с произвольными углами.

Матрицы, используемые для генерации кристаллических структур из асимметричной единицы, могут принимать одну из нескольких форм, основываясь на конкретном преобразовании, которое требуется для воспроизведения повторяющихся кристаллических единиц. В зависимости от комбинации значений целого ± 1 на диагонали (слева) это может быть либо поворот на 180 °, либо отражение. Если операция симметрии использует вращения с углами, отличными от 180 °, матрица имеет вид, показанный справа, с соответствующими значениями sin и cos.

Для генерации кристалла требуются три линейно независимых сдвига. Если переводы представлены тремя векторами a, b и c, то все точки решетки генерируются линейными комбинациями векторов с целыми коэффициентами [14]. Существует 14 типов решеток Браве, классифицированных по семи кристаллическим группам: кубическим, тетрагональным, ромбоэдрическим, ромбическим, моноклинным, триклинным и шестиугольным.

Для целей настоящей статьи пространственная группа представляет собой комбинацию одного из 14 типов решетки и от одной до трех операций симметрии. Хотя существует 230 различных пространственных групп, белки только кристаллизуются только в 65 из них из-за хиральности. Например, белок в файле PDB 1ONJ [15] кристаллизуется в космическую группу P 41 21 2 с восемью операциями симметрии; таким образом, он будет иметь восемь асимметричных единиц в элементарной ячейке. P и начальные 4 указывают на примитивный тип тетрагональной решетки. 41 указывает четырехкратную ось винта: поворот на 90o с последующим переводом 1/4 длины вектора элемента элемента c. На фиг.21 показана двукратная ось винта: поворот на 180 ° вместе с переводом 1/2 длины элементарной ячейки. 2 обозначает поворот на 180 °.

Теперь мы представляем три подробных тематических исследования анализа жесткости биологических сборок, в которых подчеркивается, почему важно анализировать белок в его функциональной форме, а не только на его асимметричной единице. Затем мы включаем три тематических исследования протеинов, анализируемых в кристаллической форме, и выявляем значительный, небольшой или никакой эффект в жесткости. Наконец, мы показываем обзор 982 кристаллических структур различных размеров, полученных из 324 файлов структуры белка.

Анализ жесткости белка может найти доминирующий жесткий кластер, размер которого существенно больше любого другого жесткого кластера или нескольких значительных кластеров сопоставимых размеров. Кластеры с размерами ниже определенного порога не учитываются в нашем анализе. Мы называем их несущественными. Они обычно относятся к гибким регионам.

В качестве первого этапа доказательной концепции, демонстрирующего важность анализа биологической сборки по сравнению с асимметричной единицей белка, мы проанализировали структуру PDB 1HHP. Это мономерная единица (половина) димерной аспартил-протеазы, которая играет важную роль в процессе созревания ВИЧ-1. Функциональная форма протеазы состоит из двух идентичных цепей, каждая из которых состоит из 99 остатков. Файл PDB 1HHP содержит только асимметричную единицу. Используя инструменты анализа BioAssembly, Curation и Rigidity KINARI, мы сравнили жесткость асимметричной единицы в 1HHP и ее биологической сборке (рис. 5).

Результаты схемы и жесткости ВИЧ-1-протеазы. Белок представляет собой димерную аспартил-протеазу (PDB-файл 1HHP) (слева). Асимметричная единица (вторая из lefft) в файле PDB имеет один значительный жесткий кластер. Две из асимметричных единиц составляют биологическую форму белка. Когда анализируется жесткость биологической формы белка (второй справа), жесткие кластеры двух отдельных мономеров объединяются в один доминирующий жесткий кластер. Черная обведенная область обозначает одну из двух шпилек β-шпильки, часто называемых закрылками, которые функционируют как химические ножницы и закрываются внутри белков для облегчения ферментативной реакции. Количество каждого типа жесткого кластера (справа) указано для асимметричных и биологических единиц (AU = Асимметричная единица, BU = Биологическая единица).

Из этих результатов видно, что асимметричная единица 1HHP имеет доминирующий жесткий кластер из 710 атомов, а все остальные кластеры имеют 19 или меньше атомов. Однако в биологической сборке 1HHP две мономерные цепи имеют жесткий кластер приблизительно 1800 атомов, что более чем вдвое превышает размер мономерной единицы. Это демонстрирует, что химические взаимодействия между двумя мономерами влияют на жесткость белка. Более того, две области лоскута идентифицированы в биологической сборке как гибкие, что согласуется с исследованиями функции белка, в которых створки перемещаются, чтобы зажать на соединения в активном месте протеазы [16].

Вирус нуклеопротеина вируса лихорадки Рифт-Валли (RVFV) [17], PDB ID 3OUO был выбран, чтобы подчеркнуть, как отдельные домены структуры вносят свой вклад в общую жесткость белка.

Асимметричная единица в этом файле PDB содержит 2-цепный димер и 1-цепный мономер; каждая цепь имеет 245 остатков. Две биологические единицы для этого белка представляют собой гексамер, сгенерированный тремя копиями димера, и гексамер, полученный с помощью шести копий мономера. Каждая мономерная цепь имеет удлиненный N-концевой рычаг.

Мы исследовали жесткость асимметричной единицы 3OUO, мономерной единицы цепи A, мономерной единицы цепи B, димера, составленного из одной копии каждой цепи A и цепи B, гексамера, состоящего из трех копий димера AB, мономер, изготовленный из цепи С, димера, состоящего из двух копий цепи С, и гексамера, состоящего из шести копий цепи С (фиг. 6). Таблицы жестких кластеров для этих компонентов биологической сборки показывают, что по мере увеличения структуры в n раз число жестких кластеров определенного размера увеличивается примерно на один и тот же коэффициент. Более пристальный взгляд на Таблицу 1 далее предполагает, что новые жесткие кластеры вводятся, когда гексамер построен из трех копий димера и когда гексамер построен из шести копий мономера. В первой биологической сборке мы обнаружили три новых кластера с 237 атомами; во втором мы обнаружили шесть новых жестких кластеров с 118 атомами каждый. Эти результаты жесткости могут быть объяснены тем фактом, что N-концевые рычаги связываются с гидрофобным карманом на поверхности соседней цепи биологической сборки, которая, как известно, стабилизирует гексамерную структуру [17].

Результаты жесткости для 3OUO — количество каждого типа жесткого кластера указано для асимметричной и биологической единицы (AU = Асимметричная единица, BU = Биологический блок).

Столбец 2 является результатом анализа асимметричной единицы, которая содержит одну копию A, B и C каждый. Столбцы 3 и 4 являются результатом получения только половины димера в асимметричной единице. Столбцы 5 и 8 представляют собой результаты получения димера (цепочки А и В) и мономера (цепь С) в асимметричной единице соответственно. Колонка 7 является результатом получения двух копий мономера (цепь C). И, наконец, столбцы 6 и 9 являются результатом генерации гексамера; первый из трех копий димера (цепи А и В), второй — из шести копий мономера (цепь С).

Результаты ригидности вируса рифтовой долины. Асимметричная единица (PDB-файл 3OUO) состоит из трех цепей: A, B и C. С помощью инструмента BioAssembly мы проанализировали жесткость только цепи A (b), цепи B (c), димера, состоящего из цепи A и B (d), цепь C (e), две копии цепи C (f), гексамер, состоящий из трех копий димера (g) и гексамера, состоящего из шести копий цепи C (h ).

Вирус вакцины D13 (файл PDS 3SAQ) является ключевым структурным компонентом внешнего леса вирусных полумесяцев [18,19]. Асимметричная единица содержит две цепи, A и B (рис. 7), каждая из которых содержит 576 остатков. Из файла PDB могут быть созданы две биологические сборки. Первый состоит из трех копий (субъединиц) цепочки A, а второй состоит из трех копий Chain B.

Анализ ригидности вируса вакцины D13. Асимметричная единица PDB-файла 3SAQ (a) состоит из двух цепей: A и B. Мы проанализировали жесткость только цепи A (b), только цепочки B (c), биологической сборки, состоящей из трех копий цепи A (g), а биологическая сборка состоит из трех копий цепи B (f). Из-за ротамера природы некоторых аминокислот атомы водорода были помещены программным обеспечением Сокращения в разные положения ротамера для определенных остатков, включая остаток 511, треонин (остаток 511 для субъединиц 1 и 2 показан в (d) и (e)), , Это привело к тому, что субъединица 1 имела различное количество водородных связей, чем субъединицы 2 и 3, что привело к несимметричной жесткости второй биологической сборки. Когда инструменты Кинари использовались для корректировки этого несоответствия водородных связей, полученная биологическая сборка была симметрично жесткой (h), как и ожидалось.

Результаты жесткости для двух биологических сборок удивительно различны, поскольку сборка 2, которая имеет доминирующий кластер, состоящий из 9475 атомов, является гораздо более жесткой, чем биологическая сборка 1, чей значительный жесткий кластер содержит гораздо меньше 2277 атомов. Чтобы исследовать это, мы рассмотрели химические взаимодействия между цепями в обеих биологических формах белка. Биологическая сборка 1 имеет 1092 водородные связи и 700 гидрофобных взаимодействий, тогда как биологическая сборка 2 имеет 1161 водородные связи и 805 гидрофобных взаимодействий. Это говорит о том, что стабилизирующие взаимодействия между тремя копиями цепи В оказывают более сильное влияние на жесткость биологической сборки 2, чем химические взаимодействия между тремя копиями цепи А в биологической сборке 1. Несоответствие жесткости между двумя биологическими сборками могут быть объяснены выводами о том, что множественные копии обеих биологических единиц образуют решетку сот, что обеспечивает структурную стабильность для незрелой вирионной мембраны [19]. Таким образом, обе биологические сборки функционируют совместно для выполнения своих структурных функций.

Кроме того, мы исследовали, почему жесткость второй биологической сборки несимметрична, хотя она состоит из трех идентичных симметричных субъединиц, которые переводятся и вращаются копии цепи B. Мы сравнивали водородные связи в каждом из три субъединицы, и обнаружили, что они имеют соответственно 385, 386 и 384 водородных связей. Дальнейшая проверка показала, что цепь В имеет несколько аминокислот, например остаток 511, треонин, к которому атомы водорода могут быть назначены несколькими способами. Треонин является одной из двух аминокислот из встречающихся в природе двадцати с двумя хиральными центрами [20], и он может существовать как четыре возможных стереоизомера (молекулы, которые имеют одну и ту же молекулярную формулу и последовательность связанных атомов, но которые отличаются только тремя -мерные ориентации их атомов в пространстве). Кроме того, треонин может принимать одну из нескольких конформаций ротамера даже среди образца того же белка [21,22], что объясняет, почему добавление атомов водорода к такому остатку может быть сделано одним из нескольких способов. Выровненные RMSD, наложенные остатки 511 для субъединицы 1 (фиг. 7f) и субъединицы 2 (фиг. 7g) имеют свои атомы водорода HG1 (как было размещено с использованием программного обеспечения Уменьшить) в разных местах ротамера, что объясняет, почему одно из них связано с водородная связь, а другая — нет.

Чтобы подтвердить, что различие количества и размещения водородных связей между тремя субъединицами второй биологической сборки является причиной несимметричной жесткости белка, мы провели парное сравнение стабилизирующих взаимодействий между тремя субъединицами. Мы определили, где три субъединицы отличаются по своим водородным связям. Чтобы исследовать эффект добавления этих водородных связей с участием ротамерных остатков, мы вручную добавили 2, 1 и 3 водородные связи к первой, второй и третьей субъединицам. Мы использовали программное обеспечение KINARI curation (шаг 4) для вставки водородных связей. В этом случае результирующая жесткость биологической сборки оказалась симметричной (рис. 7h). В таблице 2 показаны величины и размеры жестких кластеров для различных субъединиц структуры PDS 3SAQ.

Результаты жесткости для 3SAQ — количество каждого типа жесткого кластера указано для асимметричных и биологических единиц (AU = Асимметричная единица, BU = Биологическая единица).

Столбец 2 является результатом анализа асимметричной единицы, которая содержит по одному экземпляру A и B каждый, а столбцы 3 и 5 являются результатом генерирования только одной трети биологических единиц, перечисленных в столбцах 4 (три копии цепи A) и 6 (три копии цепи B) соответственно.

В этом случае поразительно, что размещение такого небольшого количества водородных связей в субъединице биологической сборки может значительно изменить жесткость тримерного белка. В этом примере добавление 6 водородных связей к уже существующему 1161 оказало глубокое влияние на жесткость биологической сборки. Этот пример подтверждает несколько исследований, в которых используется анализ жесткости для определения местоположения критических остатков.

Фокс и др. [4] продемонстрировали классификационную схему, идентифицирующую остатки, которые поддерживают трехмерную форму белка. В другом исследовании [23] был проведен анализ жесткости, в котором аминокислоты были в силиконе мутированы до глицина. Это эквивалентно удалению водородной связи (-ов), в которой участвует мутированный остаток. В этом подходе выявлены остатки, которые могут сильно нарушить жесткость белка при мутации и которые сохранялись среди нескольких гомологов.

Теперь мы перейдем к анализу кристаллических структур.

Предполагаемый белок из грамотрицательной бактерии Thermus thermophilus [24] (файл PDB 2YZT) кристаллизуется в пространственной группе P 31 2 1, которая имеет 6 связанных операций симметрии. Его малый размер (579 атомов) позволяет быстро анализировать асимметричную единицу, единичную ячейку (1x1x1), а также кристаллические решетки 2x1x1 и 2x2x1. Единичная ячейка, кристалл 2x1x1 и кристалл 2x2x1 имеют соответственно 2, 4 и 8 асимметричных единиц.

Асимметричная единица представляет собой шаровидную структуру с жесткой областью и хвостовым сегментом, который остается гибким (рис. 8). Доминирующий жесткий кластер содержит 463 атома, а все остальные жесткие кластеры содержат менее 26 атомов. Единичная ячейка (белок после применения 6 операций симметрии, то есть кристалл 1x1x1) поддерживает два значительных жестких кластера из 463 атомов, но другие жесткие кластеры элементарной ячейки объединяются, чтобы сформировать твердое тело, содержащее 2504 атома, приблизительно 6 чем размер значительного жесткого кластера в элементарной ячейке (рис. 8b). Другими словами, значительные кластеры, смежные, объединяются, чтобы сформировать доминирующее твердое тело в кристалле. Для кристалла 2x2x1 наибольшее тело содержит 14 328 атомов (табл. 3 и рис. 8в), что значительно превышает размер значительного жесткого кластера в элементарной ячейке в четыре раза. Это указывает на то, что химические взаимодействия между элементарными ячейками кристалла оказывают значительное влияние на жесткость всей кристаллической решетки.

Результаты жесткости для 2YZT.

Число каждого типа кластера показано для асимметричной единицы (AU, столбец 2), элементарной ячейки (столбец 3), кристалла 2x1x1 (столбец 4) и кристалла 2x2x1 (столбец 5)

Значительный жесткий кластер в асимметричной единице (а) файла PDB 2YZT имеет 463 атома. В элементарной ячейке и генерируемой решетке химические взаимодействия между соседними асимметричными единицами приводят к агрегации жестких кластеров отдельных единиц в доминирующую.

В предыдущем примере мы получили очень жесткий кристалл файла PDB 2LZM с очень большим доминирующим кластером. Это не всегда так. Агрегация асимметричных единиц некоторых белков в кристаллическую решетку существенно не влияет на жесткость получающейся кристаллической структуры. Мы иллюстрируем это с помощью PDB-файла 1UCS, который содержит один из четырех типов антифризных белков, обнаруженных у морских рыб, живущих при низких температурах [25]. Этот белок кристаллизуется в космической группе P 21 21 21, которая имеет 4 связанные операции симметрии. Единичная ячейка 1UCS состоит из 3 асимметричных единиц, кристалл 2x1x1 имеет 6 асимметричных единиц, а кристалл 2x2x1 имеет 12. В этом случае асимметричная единица не имеет доминирующего жесткого кластера; он имеет четыре небольших значительных кластера (рис. 9). Их число увеличивается пропорционально размеру кристалла (табл. 4).

Результаты измерения жесткости для 1UCS: показано количество каждого типа кластера для асимметричной единицы (AU, столбец 2), элементарной ячейки (столбец 3), кристалла 2x1x1 (столбец 4) и кристалла 2x2x1 (столбец 5).

Асимметричная единица (а) структуры PDU 1UCS состоит из четырех значительных жестких кластеров (и многих более мелких, которые не отображаются). В отличие от структуры PDB 2YZT (рис. 8a), ни одна из них существенно больше других. В этом случае число значительных жестких кластеров в кристаллической форме больше, чем сумма значительных жестких кластеров асимметричных единиц. Это указывает на взаимодействие между единицами, которые влияют на жесткость кристаллической структуры.

Наше последнее исследование было проведено на Ribonuclease A, которое мы анализируем на основе двух файлов PDB (5RSA и 9RSA). В одном случае (5RSA) мы увидим, что объединение асимметричных единиц в кристалл не влияет на жесткость решетки. 5RSA кристаллизуется в космической группе P 1 21 1, всего 2 операции симметрии. Асимметричная единица, содержащая один экземпляр белка, состоит из 2250 атомов. Он не имеет доминирующего кластера, а значимые — около 65 атомов. Единичная ячейка и два кристалла, которые мы проанализировали (2x1x1 и 2x2x1), имеют значительные кластеры примерно того же размера (65) (рис. 10). В отличие от предыдущих двух тематических исследований (PDB-файлов 1UCS и 2YZT), кластеры (значительные или незначительные) не сливаются на границе раздела единиц при формировании кристаллов (таблица 5). Это может быть связано с тем, что между двумя асимметричными единицами в элементарной ячейке не образуются водородные связи (данные не показаны). Мы замечаем, что между ячейками, составляющими решетку 2x1x1, появляются только 4 новых связи и только 8 в решетке 2x2x1. Однако это небольшое количество связей не исключает образования более крупных кластеров (см. Пример для 3SAQ).

Результаты жесткости для 5RSA.

Число каждого типа кластеров показано для асимметричной единицы (AU, столбец 2), элементарной ячейки (столбец 3), кристалла 2x1x1 (столбец 4) и кристалла 2x2x1 (столбец 5).

Для Ribonuclease A (PDB-файл 5RSA), который выполняет свою функцию даже в своей кристаллической форме [5], асимметричная единица (a) и ее элементарная ячейка (b) являются в значительной степени гибкими. Напротив, производная белка, которая, как известно, теряет практически всю активность [26], асимметричная единица (с) и элементарная ячейка (d) являются очень жесткими и содержат гораздо больше атомов в доминирующем жестком кластере, чем структура в файле 5RSA.

Известно, что этот белок сохраняет свою функцию в кристаллическом состоянии [5]. Это может быть связано с сохранением общей гибкости даже в кристаллической форме.

РНКаза А является широко изученным белком, для которого в PDB имеется много структурных файлов. Одной из таких записей является файл 9RSA, который является производным, который, как известно, демонстрирует полную потерю ферментативной активности [26]. Мы сравнили результаты жесткости двух форм. Структура PDB 9RSA кристаллизуется в конфигурации P 212121, а асимметричная единица содержит два экземпляра белка. Файл 9RSA PDB содержит две копии RNase A. Чтобы сделать сравнение значимым, мы сохранили только один экземпляр RNase A из файла 9RSA. Интересно, что результаты жесткости асимметричной единицы 9RSA имеют доминирующий жесткий кластер из 1339 атомов, резко контрастирующий с значительными жесткими кластерами в 5RSA.

В дополнение к предыдущим ситуационным исследованиям мы исследовали набор данных из 324 белков, в 982 биологических сборках и кристаллических формах. Как показано в таблице 6, он не смещается в сторону белков с только крупными доминирующими кластерами. Для каждого кристалла мы подсчитали, какой процент атомов структуры находился в доминирующем кластере. Мы суммировали жесткость кристаллов и информацию о доминирующем кластере в трех группах с доминирующим размером кластера более 75%, между 50 и 75% и между 25 и 50%. Мы также подсчитали количество водородных связей и гидрофобных взаимодействий каждого кристалла. Сгенерированные кристаллы варьировались по размеру, наибольший из которых имел 54107 атомов (PDB-файл 3HON, кристалл 2x2x1). Некоторые кристаллы состояли всего из одной асимметричной единицы или до 48. Созданные кристаллы неожиданно менялись с точки зрения того, сколько атомов структуры было частью доминирующего твердого тела.

Резюме набора данных для исследования кристаллических структур

Мы провели предварительную классификацию белков, основанную на жесткости их кристаллических решеток. Мы суммируем его в таблице 7. Для большинства белков мы наблюдали поведение, которое мы называем доминирующей кластерной агрегацией на всех уровнях (случай 1). Это означает, что кристалл содержит доминирующий кластер размером больше суммы доминантных кластеров в его элементарных ячейках или асимметричных единицах. Для 27 из белков (случай 2) мы наблюдали доминантную агрегацию кластеров на уровне элементарной ячейки и отсутствие агрегации на уровне кристалла. Случай 3 (33 белка) не показывает изменения жесткости среди асимметричной единицы и любого из генерируемых кристаллов. Для двадцати белков (случай 4) элементарная ячейка и кристалл 2x2x1 имели жесткие тела, которые охватывали несколько асимметричных единиц или единичных ячеек, соответственно, но кристалл 2x1x1 имел жесткие тела, которые не превышали жесткие тела в элементарной ячейке. Это может быть связано с тем, что взаимодействия между единичными ячейками вдоль одной оси кристаллической решетки могут быть разными. 10 белков в случае 5 имели асимметричные единицы и единичные клетки, у которых был такой же размерный кластер, но для кристаллов 2x1x1 и 2x2x1 наблюдался крах доминантного кластера. Случай 6 содержит те белки с доминирующим кластером на уровне элементарной ячейки, который охватывает несколько асимметричных единиц, но не агрегируется в более крупных кристаллах.

Предварительная классификация белков по свойствам жесткости их кристаллов

Были некоторые белки, которые не совсем вписывались ни в один из шести случаев. Мы заметили, что асимметричная единица и элементарная ячейка 2BF9 не изменили жесткость, но при построении кристалла 2x1x1 произошел коллапс жесткости, а кристаллы 2x1x1 и 2x2x1 имели одинаковую жесткость. Для анализа 6RXN асимметричная единица, элементарная ячейка и кристалл 2x1x1 все не имели дополнительного коллапса, но когда кристалл 2x2x1 был построен, размер крупнейшего жесткого кластера увеличивался. Хотя этот опрос далеко не полный, он уже отображает образцы свойств жесткости для кристаллов белка, которые мотивируют будущие расширения нашего программного обеспечения для полного понимания кристаллических кристаллических кристаллов.

Анализ жесткости одной асимметричной единицы может неточно отражать поведение белка в плотно упакованной кристаллической среде. Используя наше программное обеспечение KINARI, мы продемонстрировали, что дополнительную информацию о функциональности и жесткости можно получить, проанализировав биологическую сборку и / или кристаллическую структуру белка. Однако проведение крупномасштабного исследования было бы дорогостоящим вычислительным (из-за размера задействованных молекул). Преодоление этого ограничения потребует новых математических и вычислительных расширений для нашего программного обеспечения.

Для анализа больших сборок асимметричных единиц мы обнаружили, что использование программного обеспечения «черного ящика» должно приниматься с солью. В случае структур, разрешенных рентгеновским излучением, файлы PDB не содержат атомов водорода, и они должны быть размещены с программным обеспечением (таким как уменьшение). И наоборот, использование функции CINARI curation позволяет сформулировать и проверить гипотезы относительно молекулярной модели, когда размещение атомов или стабилизирующих взаимодействий необходимо устранить.

При изучении кристаллических структур мы обнаружили, что некоторые решетки содержат жесткие тела, которые охватывают несколько единичных ячеек, в то время как в других случаях единичные ячейки кристаллов сохраняют жесткие свойства их асимметричных единиц, поскольку твердые тела не объединяются в больших (Кристальная структура. Наконец, некоторые кристаллы оказались в значительной степени гибкими, поскольку элементарные ячейки не имеют стабилизирующих взаимодействий между ними. Таким образом, эта работа показывает, что анализ жесткости кристаллов белка является возможным и имеет потенциал корреляции с важными функциональными аспектами белка.

Для будущей работы мы планируем сосредоточиться на очень больших файлах PDB. Они значительно замедляют время вычислений при построении молекулярной модели, выявляют химические взаимодействия и проводят анализ жесткости. Чтобы устранить эти недостатки, можно использовать симметрию и периодичность в биологических единицах и кристаллах. Это может препятствовать вычислению местоположений всех атомов и взаимодействий между симметричными частями молекул с большими симметриями и периодичностью.

Наша вычислительная установка включает в себя следующее: мы анализируем входной файл PDB и используем информацию в нем для создания биологической единицы и желаемой кристаллической структуры. Затем мы применяем наше программное обеспечение KINARI-Web для размещения атомов водорода, идентификации химических взаимодействий и анализа жесткости, которое выводит скопления жесткости. Для проведения экспериментов мы выбрали набор данных, основанный главным образом на размере белка, по причинам, связанным с ограничениями текущей реализации. Однако мы подчеркиваем, что эти эксперименты показали, что наше программное обеспечение способно обрабатывать относительно большие белковые структуры.

Чтобы создать асимметричную единицу и кристаллическую решетку, мы применили операции симметрии, которые были даны в ЗНАЧЕНИИ 350 каждого структурного файла на каждом атоме асимметричной единицы. Мы построили элементарную ячейку с помощью supercell.py [27], скрипта Python. Он извлекает три вектора элементарной ячейки из строки CRYST1 файла PDB и генерирует элементарную ячейку, применяя операции симметрии пространственной группы на асимметричной единице. Мы построили кристалл, переведя элементарную ячейку в направлении трех векторов элементарной ячейки (рис. 11). Для самоконтроля мы сгенерировали кристаллические структуры, используя два метода: настраиваемый интерфейс к скрипту python supercell.py [27] и внутреннюю реализацию. Пример, иллюстрирующий G-связывающий белок G иммуноглобулина G (файл 2ON8 PDB), показан на рисунке 1 (слева).

Мы создали элементарную ячейку (а) из асимметричной единицы белка 2ON8. В (b) элементарная ячейка преобразуется с использованием векторов элементарных ячеек для генерации кристаллической решетки 2x1x1.

В таблице 8 приведены шаги нашей экспериментальной установки и методы генерации и анализа кристаллов из файлов структуры PDB. Расширенную функцию поиска PDB использовали для выбора белков, которые имели от 50 до 150 остатков, структура которых определялась с помощью рентгеновской кристаллографии. Были выбраны только белки без ДНК и РНК.

Резюме экспериментальной установки

Для создания биологической сборки белка мы использовали матрицы перевода и вращения, включенные в заголовок файла PDB. Мы применили операции преобразования, которые были заданы в виде матриц в ЗАМЕЧАНИИ 350 каждого структурного файла на каждом атоме асимметричной единицы. Каждая матрица содержит трехмерную матрицу поворота и три вектора переноса (по одной для каждой оси). Список вторичных структур также был обновлен ссылками на вновь созданные координаты атомов.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

ИС задумал исследование и контролировал проект. TL реализовал код BioAssembly, ПК и JG часть Crystal, а FJ контролировал разработку кода и выполнял интеграцию KINARI. Предварительные эксперименты, тематические исследования и опрос проводились TL, PC, JG и SM. IS и FJ проанализировали результаты и написали статью.

В этой статье мы представляем методологию и экспериментальные вычислительные результаты, которые расширяют нашу предыдущую работу. В более ранней версии, появившейся в расширенном абстракте, мы сообщали о экспериментах по жесткости ограниченного числа кристаллических структур. В этой работе мы представляем и демонстрируем новую особенность KINARI для генерации биологических единиц и анализируем их жесткость. В этой статье также представлены инструменты для кристаллов и биологических единиц, которые свободно доступны на веб-сайте KINARI.

Исследование FJ и IS финансировалось Национальным институтом общих медицинских наук DMS-0714934 в рамках Совместной программы по математической биологии при поддержке Управления математических и физических наук Национального научного фонда и Национального института общих медицинских наук Национальные институты здравоохранения. ПК и СМ были поддержаны финансируемым NSF Центром по математике женщин в Колледже Смита.

Публикация этой статьи была поддержана DMS-0714934, NSF CCF-1016988 и DARPA 23 «Математические вызовы».

Эта статья была опубликована в рамках Bioinformatics BMC. Том 14 Приложение 18, 2013: Избранные статьи второй Международной конференции IEEE по вычислительным достижениям в био и медицинских науках (ICCABS 2012): Биоинформатика. Полное содержание дополнения доступно в Интернете по адресу: http://www.biomedcentral.com/bmcbioinformatics/supplements/14/S18.

Это расширенная публикация статьи «Периодическая жесткость кристаллических структур белка» [28], которая была представлена ​​на 2-й Международной конференции IEEE по вычислительным достижениям в области биологических и медицинских наук (ICCABS). В этой работе мы проводим анализ многих других кристаллических структур, чем проанализировали в публикации ICCABS. Здесь мы также вводим несколько новых функций программного обеспечения KINARI, включая возможность создания биологических единиц из асимметричной единицы в файле PDB. Данные для трех тематических исследований анализа жесткости биологических сборок, представленных в этой публикации, были получены с использованием этих новых инструментов KINARI, которые являются общедоступными.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *