Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

3′-Переработка и перенос нитей, катализируемый ретровирусной интегразой в кристалле

3′-Processing and strand transfer catalysed by retroviral integrase in crystallo
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3395085/

Эти авторы внесли одинаковый вклад в эту работу

Структуры прототипа интегразы, связанной с вирусной кДНК, дают представление о ранних стадиях интеграции генома ретровирусного хозяина и в механизмы действия ингибиторов переноса вирусных ДНК (INSTI).

Ретровирусная интеграза (IN) ответственна за две последовательные реакции, которые приводят к введению копии вирусной ДНК в хромосому клетки-хозяина. Первоначально фермент удаляет ди- или тринуклеотиды из концов вирусной ДНК, чтобы разоблачить 3′-гидроксилы, присоединенные к инвариантным динуклеотидам CA (реакция 3′-обработки). Во-вторых, он вставляет обработанные 3′-вирусные ДНК-концы в хромосомную ДНК хозяина (перенос цепи). Здесь мы сообщаем о кристаллической структуре прототипа пенистого вируса IN, связанного с вирусной ДНК, до 3′-обработки. Кроме того, воспользовавшись его зависимостью от кофакторов ионов двухвалентного металла, мы смогли заморозить захват вирусного фермента в его основных состояниях, содержащих все компоненты, необходимые для 3′-обработки или переноса нити. Наши результаты проливают свет на механику интеграции ретровирусной ДНК и объясняют, почему ингибиторы переноса ВИЧ в отношении ВИЧ неэффективны против 3′-процесса обработки интеграции. Структуры основного состояния, кроме того, подчеркивают поразительную мимику субстрата, используемую ингибиторами в их связывании с активным центром IN, и предлагают способы улучшения этого клинически значимого класса малых молекул.

Ретровирусный жизненный цикл зависит от введения вирусной ДНК в хромосому клетки-хозяина, а интеграза (IN) представляет собой фермент, который организует ключевые каталитические события, участвующие в этом процессе (см. Craigie, 2002; Lewinski and Bushman, 2005). IN ответственна сначала за 3′-обработку, реакцию, в которой два или три нуклеотида удаляются из одного или обоих концов 3′-вирусной ДНК, оставляя 3′-гидроксильные группы. IN впоследствии катализирует перенос нитей, где он использует 3′-гидроксилы для атаки пары фосфодиэфирных связей в ДНК клетки-хозяина.

Retroviral INs содержат три канонические домены: цинкосвязывающий N-концевой домен, каталитический основной домен, содержащий активный сайт и C-терминальный домен (Engelman and Craigie, 1992; Kulkosky et al., 1992; Hare et al, 2010a). Активный сайт IN содержит триаду инвариантных кислотных остатков, называемую мотивом D, DX35E (Engelman and Craigie, 1992; Kulkosky et al., 1992; Dyda et al, 1994). Карбоксилаты координируют пару катионов двухвалентных металлов, необходимых для обеих ферментативных активностей. Обильный in vivo Mg2 + считается естественным кофактором, хотя Mn2 + полностью поддерживает функцию IN in vitro (Bushman and Craigie, 1991; Engelman and Craigie, 1995; Andrake et al, 2009; Hare et al, 2010a). Обе реакции, катализируемые активным центром IN, протекают через бимолекулярное нуклеофильное замещение (SN2), разделяемое металлозависимыми нуклеотидилтрансферазами и некоторыми нуклеазами, включая транспозазы и ферменты РНКазы H (Engelman et al., 1991; Mizuuchi and Adzuma, 1991; Davies et al. , 2000; Kennedy et al., 2000; Nowotny and Yang, 2006). Считается, что кофакторы ионов металлов играют двойную роль при катализе. Из-за предпочтительной октаэдрической геометрии координационных сфер Mg2 + и Mn2 + (Harding, 2006) ионы первоначально помогают выбирать и позиционировать реагирующие группы. Во-вторых, они помогают дестабилизировать бесщеточный фосфодиэфир и способствовать образованию промежуточного соединения фосфора (Nowotny and Yang, 2006; Yang et al, 2006).

Ретровирусная интеграция разделяет общий набор промежуточных продуктов со многими системами транспонирования ДНК (рис. 1А) (Li et al, 2006; Li and Craigie, 2009). Первоначально тетрамер IN собирает на вирусной ДНК концы, образуя intasome. После 3′-обработки, intasome связывает ДНК-мишень в переходном комплексе-захвате цели (TCC). После переноса нити, пост-каталитический переносной комплекс (STC), вероятно, требует энергозависимой разборки до 5′-концевого соединения с помощью механизма восстановления ДНК хозяина. В контексте этой работы полезно различать две формы интасомы: ее исходное состояние, содержащее необработанные (тупые) вирусные ДНК-концы и его состояние после 3′-обработки. Здесь мы относим эти комплексы как нерасщепленные и расщепленные интасом (UI и CI) соответственно. Интасом в состоянии после 3′-обработки (CI), TCC и STC были недавно структурно охарактеризованы с использованием IN из прототипа пенистого вируса (PFV) (см. Cherepanov et al, 2011). CI содержит димер димеров IN, где центральная пара IN-субъединиц образует сеть белково-белковых и белково-ДНК-взаимодействий и взаимодействует с обработанными 3′-вирусными концами ДНК в их активных сайтах (Hare et al, 2010a). Все три канонические области внутренних IN-субъединиц участвуют в белково-белковых и белково-ДНК-взаимодействиях. Внешние цепи IN взаимодействуют с внутренними цепями через каталитические основные домены. В TCC ДНК-мишень связывается в канавке, образованной между внутренними IN-субъединицами в сильно изогнутой конформации, вынуждена приводить целевые фосфодиэфиры к активным сайтам IN (Maertens et al, 2010).

ВИЧ-1 IN является проверенной лекарственной мишенью с ралтегравиром, который в настоящее время используется для лечения СПИДа, а несколько связанных ингибиторов находятся в клинических испытаниях (Summa et al, 2008) (см. Marchand et al, 2009; McColl and Chen, 2010). Эти небольшие молекулы классифицируются как ингибиторы переноса нитей IN, поскольку они специально нацелены на второй каталитический этап процесса интеграции (Espeseth et al, 2000). Хотя ингибирование 3′-обработки может наблюдаться в присутствии повышенных концентраций этих молекул (Metifiot et al, 2010), вряд ли это будет способствовать их противовирусной активности. Струнные переходные блоки ингибитора переноса содержат две функциональные группы, гетероциклическое ядро, содержащее триаду металлических хелатообразующих атомов (как правило, трех оксигенов) и гало-бензильную боковую цепь, соединенную с помощью короткого, крутильно гибкого линкера. Высокая степень сохранения последовательности в активных участках ретровирусных INs позволила использовать интрасому PFV в качестве суррогата для своего аналога HIV-1 (Hare et al, 2010a, 2010b, 2011). В кокристаллических структурах PFV CI-ингибитора металлическая хелатная триада взаимодействует с катионами Mg2 + в активном сайте IN, в то время как гало-бензильная боковая цепь вытесняет основание реакционноспособного дезоксиаденозина на обработанном конце 3′-вирусной ДНК (Hare et al, 2010a, 2010b, 2011).

Наша предшествующая работа была посвящена посткаталитическим (CI и STC) или инактивированным (TCC, не содержащим 3′-гидроксилов или ионам каталитических металлов) комплексам IN-DNA (Hare et al, 2010a; Maertens et al, 2010). Здесь мы представляем кристаллические структуры функционального UI и TCC в их основных состояниях, совершенных для 3′-обработки и переноса нитей, соответственно. Структуры обеспечивают беспрецедентное понимание положения ионов металлов и химически реагирующих групп в активном центре IN, выделяют мимику субстрата, используемую ингибиторами переноса нитей, в режиме их связывания с IN и объясняют, почему эти малые молекулы неэффективны против 3′- и почему ингибиторы 3′-обработки были труднее развиваться.

Мы смогли собрать и кристаллизовать интрасому PFV, содержащую тупоконечную ДНК длиной 19 п.о., имитирующую необработанный конец U5 вирусной ДНК (комплекс, называемый UI). Мы также получали кристаллы PFV TCC, путем сокристаллизации CI и молекулы ДНК-мишени 30-б.п. (Maertens et al, 2010). Оба типа кристаллов выращивали в присутствии ЭДТА для хелатных следов ионов двухвалентного металла и предотвращали катализ во время кристаллизации.

Для оценки функциональности активного сайта IN в кристаллизованных формах мы впитывали кристаллы UI и TCC в растворах, содержащих соли Mn2 + или Mg2 +. Кристаллы растворяли, и ДНК-материал, 5′-меченный инкубацией с полинуклеотид-киназой и -32P-АТФ, фракционировали с помощью денатурирующих полиакриламидных гелей. Две 19-мерные нити необработанного ДНК-дуплексной ДНК-ДНК мигрируют как дублет с четким разделением продукта реакции 17-мерного действия (фиг. 1В, дорожки 1 и 2). Ни 3′-обработка, ни перенос нитратов не были обнаружены до воздействия кристаллов UI и TCC на соли Mg2 + или Mn2 + (фиг. 1В, дорожка 3, фиг. 1С, дорожка 7). Продукты 3′-обработки стали обнаруживаться после вымачивания кристаллов UI в MnCl2 в течение 5 мин, и реакция была завершена на 50% через 120 мин (на основе относительных интенсивностей R и r-полос, фиг.1В). При оптимизированных условиях in vitro реакции переноса нитей с использованием PFV IN и тупой вирусной ДНК-мимики задерживаются на ~ 30 мин по сравнению с использованием предварительно обработанной вирусной ДНК (Valkov et al, 2009). Таким образом, временная шкала реакции 3′-обработки в кристалле не сильно отличалась от таковой в растворе. Трансформация струны происходила быстрее, чем 3′-обработка, причем продукты появляются через 30 с замачивания кристаллов TCC в присутствии Mn2 + (рис. 1C, дорожка 8), и реакция заканчивается более чем на 50% через 2 минуты (дорожка 10). Важно отметить, что как Mn2 +, так и Mg2 + могут действовать как кофакторы как для катализируемых IN-реакций в кристалле (рис. 1B-полосы 9 и 10, рисунок 1C, полосы 13 и 14). Эти результаты подтвердили, что интрасомные и TCC-комплексы являются функциональными в их кристаллизованных формах.

Мы собрали данные дифракции рентгеновских лучей и рафинированные структуры UI в отсутствие металлических кофакторов (UIApo) и после замачивания кристаллов в растворах, содержащих Mn2 +, в разные периоды времени (дополнительная таблица S1, дополнительная фигура S1). В качестве более электронного плотного элемента, чем Mg, Mn позволяет более точно определять позиции металла в кристаллических структурах при заданном диапазоне среднего и низкого разрешения (2,5-3 Å). 5-минутный выжим позволил нам заморозить ловушку комплекса Михаэлиса с полным заполнением для ионов металлов, а структура была уточнена до разрешения 2,5 Å (UIMn; рисунок 2A). Длительные выдержки (24-48 ч) показали структуру (CIMn), которая была неотличима от структуры интрасом, собранной на предварительно обработанных концах вирусной ДНК (Hare et al, 2010a, 2010b); расщепленный динуклеотид не наблюдался в электронной плотности, что указывает на то, что он диссоциировался с активного сайта (дополнительный рисунок S1). Мы также определили структуру UI с 5′-фосфорилированными нереактивными вирусными цепями ДНК (UIMn-PO3, дополнительный рисунок S2A). Добавление фосфатной группы не влияло на конфигурацию активного сайта IN (дополнительный рисунок S2B). Это ожидалось, так как 5′-конец нереактивной вирусной ДНК-нити заправлялся за пределы активного сайта (рис. 2B) (Hare et al, 2010a).

3′-Обработка не оказывает существенного влияния на общую структуру интасомы, а r.m.s. отклонение между позициями атомов основной цепи IN в UIMn (рис. 2A) и структурами CIMn (Hare et al, 2010a, 2010b) составляет всего ~0,35 Å. Разделяя все основные архитектурные особенности, описанные для расщепленного комплекса (Hare и др., 2010a), структуры пользовательского интерфейса показывают активный сайт IN, выделенный для 3′-обработки и конфигурации реакционного субстрата. Три основания не имеют вируса на конце вирусной ДНК из-за введения петли плутония №2 и п2 / β5 IN 310 между реактивными и нереактивными вирусными цепями ДНК (фиг. 2В). Прерывание концов вирусной ДНК до 3′-обработки полностью согласуется с биохимическими наблюдениями (Scottoline et al, 1997; Katz et al, 2011). Радиационный pApTOH динуклеотид проходит через Pro214 и между Tyr212 и Gln186 и выступает в канавку между половинами симметричной интасомной структуры (рис. 2A и 3A). Взаимодействия между основами расщепленного динуклеотида и IN ограничиваются контактами Ван-дер-Ваальса с остатками IN 212-214 (фиг. 3A), а его 3′-концевой тимидин лишь частично упорядочен в электронной плотности. Связывающие взаимодействия расщепляющегося динуклеотида в активном центре IN производятся исключительно через основную цепь фосфодиэфира ДНК, которая хорошо определена в электронной плотности (фиг. S1). Внутренний фосфодиэфир динуклеотида связан с водородными связями с магистральными амидами Tyr212 и Gln186 и делает взаимодействие Ван-дер-Ваальса с боковой цепью Tyr212 (фиг. 3A). Два иона Mn2 + связываются на активном участке, что приводит к перемещению подщелачивающего фосфодиэфира к активному участку (сдвиг в положении 1,6 А в положении атома Р, фиг. 3В). В отсутствие ионов металлов фосфодиэфир менее ограничен, что приводит к более высоким B-факторам для расщепляющегося динуклеотида и расстройству 3′-тимидина (дополнительный рисунок S1).

Октаэдрическая координационная сфера металла A в UIMn почти идеальна, включая кислород из каждого из карбоксилатов Asp128 и Asp185, про-S
p кислородного атома фосфодиэфира скрещивания плюс три молекулы воды, одна из которых (показанная как большая сфера на рис. 3C), готова для линейной нуклеофильной атаки на кремниевый фосфодиэфир. Металл B разделяет не-мосты pro-S
p кислород с металлом A, а также контактирует с мостиковым 3′-кислородным атомом кремниевого фосфодиэфира, как атомами кислорода из карбоксилата Glu221, так и одним из боковой цепи Asp128, плюс одна молекула воды. Из-за бидентативной координации с Glu221 и скребкового фосфодиэфира координационная сфера металла B далека от оптимальной октаэдрической геометрии (Harding, 2006). Таким образом, как и в случае комплекса РНКазы H-субстрата (Nowotny and Yang, 2006), неидеальная среда лиганда металла B может способствовать дестабилизации скребковой связи.

Расстояние между ионами металлов в UIMn-комплексе составляет 3,9 Å (рис. 3D), что очень близко к тому, которое наблюдается в структурах, несущих состояние Н-субстрата РНКазы (Nowotny et al, 2005). Диссоциация расщепленного динуклеотида позволяет металлам двигаться ближе друг к другу, разделенных на 3,1 Å в CIMn. Nowotny and Yang (2006) наблюдали переменные позиции металлов в активном сайте РНКазы H, в зависимости от стадии каталитического процесса. Их предположение о том, что перемещение ионов металлов во время катализа может позволить молекуле атакующей воды приближаться к кремниевому фосфодиэфиру, подтверждается симуляцией молекулярной динамики (De Vivo et al, 2008; Rosta et al, 2011). В нашей основной структуре UIMn водный нуклеофил отделяется от целевого атома фосфора на 3,3 Å, что совпадает с расстоянием, наблюдаемым в комплексах РНКазы H-субстрата (Nowotny et al, 2005). Следует отметить, что более ранняя работа должна была полагаться на инактивацию мутаций в активном сайте РНКазы Н, чтобы стабилизировать состояние, связанное с субстратом. Наше наблюдение за водой в идентичном положении в активном сайте функционального IN сильно аргументирует его функциональное значение.

Конфигурация активного сайта UIMn объясняет наблюдения, сделанные Брауном и его коллегами более десяти лет назад, что реакция ВИЧ-1 IN 3′-реакции сильно ингибируется, когда про-S
p кислород подщелачивающего фосфодиэфира заменен на серу, в то время как такой эффект не наблюдался при про-R
p (Gerton et al, 1999). В структуре UIMn pro-S
p кислород распределяется между ионами металлов (фиг. 3C). В качестве более электроотрицательного и меньшего атома кислород был бы предпочтительным в этом положении (Brautigam and Steitz, 1998), тогда как замены про-R
p кислород, который указывает от металлических кофакторов (рис. 3C), с меньшей вероятностью влияет на катализ.

Нуклеофильное замещение требует двух событий переноса протонов: сначала из нуклеофила воды (образующего реактивный гидроксидный анион), а затем на 3′-алкоксида (образующего уходящий 3′-гидроксил). Было предложено, чтобы в RNase H про-R
p атома кислорода в фосфодиэфирной группе, расположенной на 3 ‘участка расщепления, служит общей основой для абстрагирования протона от атакующей молекулы; и что протонированный карбоксилат, координированный с металлом В, подает протон на 3′-алкоксид, завершающий каталитический цикл (Rosta et al, 2011). В структуре UIMn внутренний фосфодиэфир расщепляющегося динуклеотида вряд ли будет действовать как общее основание в исходном переносе протонов, так как его атомы, не являющиеся мостиковыми атомами кислорода, указывают от молекулы атакующей воды и связаны водородом с амидами основной цепи. Во-вторых, в отличие от ситуации в РНКазе Н координационная сфера металла В в UIMn включает молекулу воды, которая может обеспечить протон для уходящего 3′-алкоксида. Таким образом, несмотря на близкое сходство, системы РНКазы H и IN, вероятно, отличаются некоторыми деталями своих каталитических механизмов. Моделирование квантовой молекулярной механики может помочь объяснить механизм передачи протонов во время 3’-обработки.

Поскольку передача струн в кристаллах TCC относительно быстро (рис. 1C), значительные усилия были потрачены на оптимизацию условий замачивания металлов и защелкивания при использовании более 200 кристаллов TCC. Очень короткие выдержки (<1 мин) приводили к преобладающему связыванию одного иона Mn2 + в положении B, оставляя положение А только частично занятым (TCCMn *, звездочка указывает на раннее промежуточное соединение), в то время как инкубация в течение 2,5 мин или дольше приводила к полной цепочке перевод. Замачивание кристаллов TCC с Mn2 + для промежуточных периодов часто оказывало вредное влияние на дифракционный предел, предположительно из-за индуцированной кристаллической неоднородности. После большого количества испытаний мы смогли получить набор данных с разрешением 3,0 А из 1,5-минутного вымачивания, в котором был обнаружен активный участок TCC, занятый металлом, готовый для переноса нитей (TCCMn). Две независимые структуры посттрансляционных состояний, STCMn * (раннее промежуточное соединение) и STCMn (поздние), были уточнены с использованием данных дифракции, собранных из кристаллов TCC, инкубированных в присутствии Mn2 + в течение 2,5 мин и 2 ч, соответственно. Кроме того, структура бесхлоридного TCC (TCCApo) была доработана до 3,15 Å разрешения (дополнительная таблица S1, см. Также дополнительную диаграмму S3 для окончательного и смоделированного отжига, не отображающего карты плотности электронов уточненных моделей). Следует отметить, что кинетический анализ переноса нитей за счет растворения пропитанных кристаллов TCC и радиоактивно меченых субстратных и продуктовых ДНК (рис. 1C) предполагал более быструю реакцию на реакцию, наблюдаемую с помощью рентгеновской кристаллографии; кажущееся расхождение объясняется различными методами, используемыми для прекращения реакции-замачивания в ЭДТА по сравнению с мгновенным замораживанием.

Фосфодиэфирная основа ДНК-мишени в TCC перекрывается с фосфодиэфирной основой ДНК-мишени в UI (рисунок 4A). Однако ДНК-мишень в TCC протекает в противоположном направлении к типу вирусной ДНК в пользовательском интерфейсе. Основания и рибозные фрагменты целевой цепи, будучи дополнительно спаренными под парусом, как часть дуплекса, не находятся в том же положении, что и у раковины вирусного динуклеотида. Кроме того, целевая фосфодиэфирная группа (обозначенная цифрой 0 на фигуре) имеет инвертированную ориентацию по сравнению с целевым фосфодиэфиром вируса (рис. 4А).

При загрузке ДНК-мишени металлические кофакторы перемещаются дальше друг от друга, причем межметаллическое расстояние увеличивается от 3,1 Å в CIMn до 3,8 Å в TCCMn из-за взаимодействия с целевым фосфодиэфиром (рисунок 3D). Это расстояние между металлами очень близко к такому, которое наблюдается в комплексах UIMn и РНКазы основного состояния основного состояния. Фосфодиэфир, расположенный на 5 ‘целевого сайта (обозначенный -1 на рисунке 4A), взаимодействует с амидами основной цепи остатков Tyr212 и Gln186, сходными с аналогично расположенным вирусным ДНК-фосфодиэфиром в пользовательском интерфейсе (рисунок 3A). Как и в случае активного сайта UIMn, pro-S
p атома кислорода целевого фосфодиэфира разделяют между ионами металлов, тогда как про-R
p атом удаляется от металлов (рис. 4B). Эта конфигурация объясняет отрицательные эффекты тиосубститутов при про-S
p в целевой ДНК по активности переноса нити IN (Gerton et al, 1999). Металл А дополнительно взаимодействует с 3′-мостиковым атомом кислорода из целевого фосфодиэфира и одного атома кислорода из каждого из карбоксилатов Asp128 и Asp185. Металл В связан с обоими атомами кислорода из боковой цепи Glu221, второго атома карбоксилата Asp128 и 3′-гидроксильной группы из вирусной ДНК. Молекулы воды, не полностью различимые при разрешении дифракционных данных, предположительно дополняют координационные сферы обоих металлов. 3’-гидроксил вирусной ДНК готов для линейной нуклеофильной атаки на целевой фосфодиэфир, отделенный от его атома фосфора на ~ 2,8 Å (путь отмечен красной черточкой на рисунке 4B).

Как предсказано Nowotny et al (2005), роли кофакторов ионов металлов переключаются между 3′-обработкой и переносом нитей, и именно металл B активирует атакующую 3′-гидроксильную группу в TCC. После переэтерификации ионы металлов снова сближаются (3,2 Å в STCMn *, рис. 3D), сопровождающиеся выбросом фосфодиэфира, связывающего линии вируса и хозяина с активным сайтом (рис. 4B). Сравнивая структуры индивидуально кристаллизованных PFV TCC и STC, мы наблюдали аналогичное перемещение недавно сделанной фосфодиэфирной связи с активного сайта и постулировали, что это изменение служит для того, чтобы сделать реакцию переноса нитей необратимой (Maertens et al, 2010). Однако, поскольку исходные кристаллы TCC и STC выращивались в разных условиях, неясно, произошло ли изменение конформации во время реакции или каким-то образом было выполнено во время кристаллизации STC. Тот факт, что выброс фосфодиэфира наблюдается при передаче нити в кристалле, сильно поддерживает его функциональную значимость.

Структура STCMn *, определенная из кристаллов TCC, пропитанных в течение 2,5 мин в присутствии MnCl2, содержит два иона Mn2 +, очищенные при полном заполнении. Более длительные замачивания (> 1 ч) приводили к структурам с ионами Mn2 +, связанным в положении А, в то время как положение B было в большинстве случаев занято, например, в случае STCMn (дополнительный рисунок S3), что указывает на медленную диссоциацию металла B после нити перевод. Аналогично, кристаллы СТС, выращенные в присутствии Mg2 +, имели один металл в активном центре (Maertens et al, 2010). Мы предполагаем, что кажущаяся потеря аффинности связывания металла B после переноса нити обусловлена ​​выбросом новообразованного фосфодиэфира из активного сайта.

Относительно медленная кинетика и зависимость ИЛ катализируемых реакций металлов позволили нам заморозить ловушку соответствующих комплексов Михаэлиса, образовавшихся до 3′-обработки и переноса нитей, не прибегая к использованию инактивирующих мутаций или отстроенных условий реакции. Полученные структуры не только проливают свет на механику активного объекта IN, но также дают много информации, относящейся к развитию ингибитора ВИЧ-инфекции. Связывание ингибитора переноса Strand с ретровирусной интасомой, прошедшей 3′-обработку, требует смещения 3′-дезоксиаденозина из активного сайта IN (Hare et al, 2010a, 2010b). Структура UIMn дает очевидное объяснение выраженной селективности этого класса малых молекул к ингибированию передачи нитей (Espeseth et al., 2000). В самом деле, связывание ингибитора переноса цепи с интасом перед 3′-обработкой потребовало бы, чтобы дезоксиаденозин оставил активный участок вместе с нерасщепленным 3′-динуклеотидом (рис. 5) за счет нарушения дополнительных взаимодействий (фосфат-металл и фосфат-амид, фиг. 3А и С). Тем не менее, конфигурация активного сайта в комплексе UIMn не обязательно препятствует разработке специфических ингибиторов 3′-обработки, которые не требуют выброса тринуклеотида. Связывание небольшой молекулы на вирусной ДНК-IN-интерфейсе и замена молекулы атакующей воды инертным металлом хелатирующего атома (например, кислорода sp2) препятствовали бы реакции. Образование производных 5′-сложного динуклеотида во время 3′-обработки ретровирусными INs в присутствии глицерина и других спиртов (Vink et al., 1991; Dotan et al., 1995) указывает на то, что ряд нуклеофилов может получить доступ к каталитическому центру. В принципе, с умело разработанным лигандом может быть возможно заменить все три молекулы воды, связанные с металлом А, в состоянии предварительной обработки. Однако кажущаяся мобильность расщепляющегося динуклеотида может представлять проблему для конструкции ингибитора 3′-обработки. 3′-нуклеотид только частично упорядочен в нашей структуре UIApo и отображает более высокие, чем средние B-факторы, даже в UIMn. Поэтому неудивительно, что его 3′-гидроксил может иногда заменять нуклеофил воды, объясняя образование циклического динуклеотидного аддукта, обнаруживаемые количества которых наблюдались при 3′-обработке различными ретровирусными INs in vitro (Engelman et al., 1991) Dotan et al, 1995).

Сравнение основных структур состояний, представленных здесь с связующими ингибиторами переноса нитей CI (Hare и др., 2010a, 2010b, 2011), подчеркивает интригующий случай миметики субстрата, используемой этими препаратами. Суперпозиция UIMn, TCCMn и raltegravir-bound CI (PDB ID 3OYA) помещает средний атом кислорода металлической хелатной триады в положение, обычно занимаемое про-S
p атомов кислорода целевого или вирусного ДНК-фосфадиэфира (рис. 5, дополнительный рисунок S4). Кислородный атом, дистальный от гало-бензильной боковой цепи ингибитора, одновременно имитирует молекулу атакующей воды в течение 3′-обработки и мостиковый атом кислорода целевого фосфодиэфира во время переноса нити. Третий кислород триады, кроме того, имитирует атакующую 3′-гидроксильную группу во время переноса нити и мостиковый кислород подщелачивающего фосфодиэфира во время 3′-обработки (рис. 5). Представленные здесь основные структуры состояния могут позволить детальное моделирование молекулярной динамики как IN-катализируемых реакций. Расчет связанных переходных состояний фосфодизеров скребковых / целевых фосфодиэфиров, скорее всего, выделит более оптимальные положения для металлических хелатообразующих атомов и конструкцию более жестких ингибиторов переноса связывания. Структурная несовместимость ДНК-мишени, связывающейся с интасом перед 3′-обработкой (фиг. 4А), указывает на то, что разреженный динуклеотид может фактически служить в качестве ингибитора переноса естественной цепи. Необходимость завершения 3′-обработки может ограничивать способность неполностью собранных комплексов вирусных нуклеопротеинов взаимодействовать с ДНК-мишенью и, возможно, уменьшать вероятность самоубийственной автоинтеграции.

Взаимодействие между внутренними атомами IN и реакционноспособными фосфодиэфирами, наблюдаемыми в структурах UI и STC (фиг. 3C и 4A), вероятно, помогает выровнять основную основу ДНК и активный сайт фермента. Амиды основной цепи PFV IN, участвующие в этих контактах, относятся к Tyr212 и Gln186 (соответствующим ВИЧ-1 IN Tyr143 и Asn117 соответственно) и непосредственно упираются в карман, связывающий лекарство. Из ингибиторов переноса нитей, характеризуемых структурно (Hare et al, 2010a, 2010b, 2011), только ралтегравир образует водородную связь с амидом тира (рис. 5). Небольшой молекулярный лиганд, который оптимально воспроизводит оба этих взаимодействия, можно предсказать, что он будет более жестко связываться с активным сайтом IN, независимо от изменений локальной последовательности. Поверхность IN, участвующая в взаимодействиях Ван-дер-Ваальса с первым основанием расщепленного динуклеотида, может представлять собой еще одну важную точку контакта (рис. 3A). Примечательно, что ингибитор переноса нитей второго поколения MK2048 и его аналоги делают контакты в этой области (Vacca et al, 2007; Hare et al, 2010b). Недавние биохимические данные указывают на корреляцию между ингибиторной активностью против резистентных к ралтегравиру вариантам ВИЧ-1 и более жестким связыванием с IN (дистрофатом дикого типа) (Grobler et al., 2009; Hightower et al, 2011). Наши результаты показывают функционально важные контактные точки, которые еще не были полностью изучены в текущих ингибиторах ВИЧ-инфекции, что повышает надежды на то, что соединения следующего поколения могут быть разработаны на основе имеющейся в настоящее время структурной информации.

UI был приготовлен и кристаллизован, как описано ранее для расщепленного комплекса (Hare et al, 2010b) с использованием олигонуклеотидов 5′-TGCGAAATTCCATGACAAT-3 ‘и 5′-ATTGTCATGGAATTTCGCA-3′, имитирующих перенесенные и нереактивные нити соответственно. Для некоторых экспериментов нереактивная нить ДНК синтезировалась с 5’-фосфатом для подавления ее обнаружения на радиоактивных гелях. TCC получали, как описано ранее (Maertens et al, 2010), в присутствии 2,5 мМ ЭДТА и кристаллизовали при 18 ° С путем диффузии паров с раствором резервуара 2,5 мМ ЭДТА, 180 мМ Li2SO4, 34% ПЭГ-400 и 0,1 М Трис-HCl, pH 7,4, в каплях 1 мкл комплекса IN-DNA и 1 мкл раствора пласта.

Кристаллы переносили в капли, содержащие пластовый раствор плюс 25 мМ MnCl2 или MgCl2, и инкубировали при 18-20 ° C. Чтобы обнаружить продукты реакции, кристаллы промывали трижды 2 мкл каплями пластового раствора без ионов металла плюс 5 мМ ЭДТА перед переносом в 10 мкл солюбилизирующего буфера, содержащего 5 мМ ЭДТА, 1% (мас. / Об.) ДСН, 0,1 M Tris-HCl, pH 9,0. Образцы, дополненные 10 мкг протеиназы К, инкубировали при 37 ° С в течение 1 часа. Протеазу и SDS удаляли экстракцией двумя изменениями фенол-хлороформ-изоамилового спирта (25: 24: 1, pH 8,0). После двух дополнительных экстракций хлороформом образцы сушат досуха и повторно растворяют в 10 мкл 10 мМ MgCl2, 50 мМ Трис-HCl, pH 7,4. Продукты ДНК были маркированы 5′-концами с использованием γ-32P-ATP и термостабильной полинуклеотид-киназы Clp1 при 80 ° C (Jain and Shuman, 2009). Маркированные виды ДНК, выделенные на 20% полиакриламидных гелевых мочевинах, были обнаружены путем фосфорирования. РНК-специфические 5′-ОН-киназы, такие как полинуклеотид-киназа Clp1 или T4, действуют на непарные 5′-концы (Wang et al, 2002). Хотя обе киназы были смещены в сторону фосфорилирования нереактивной нити дуплексной ДНК (нить N, фиг. 1А), которая отображает выступающий 5′-конец после 3′-обработки, термостабильный фермент лучше работает при маркировке других видов ДНК, присутствующих в кристаллах , Для рентгеноструктурных исследований после вымачивания в присутствии 25 мМ MnCl2 для заданных времени инкубации кристаллы замораживали замораживанием в жидком азоте и хранили до сбора данных при 100 K.

Данные рентгеновской дифракции были собраны на пучках I02, I03 и I04-1 Алмазного источника света (Oxfordshire, UK). Данные, объединенные с использованием Mosflm (Leslie, 1992) или XDS (Kabsch, 2010), были объединены и масштабированы в Scala (Evans, 2006). Структуры были решены путем изоморфного замещения с использованием PDB ID 3OY9 (для структур UI), 3OS0 (для STC) или 3OS1 (для TCC) в качестве исходных моделей. Coot (Emsley and Cowtan, 2004) использовался для создания ручных моделей и Refmac (Murshudov et al, 1997) и Phenix (Zwart et al, 2008) для уточнения структуры. Все конечные модели имели хорошую геометрию (дополнительная таблица S1), как оценивается Molprobity (Davis et al, 2007). В Phenix были созданы композитные симулированные отжиговые карты (дополнительный рисунок S3). Все структурные иллюстрации были созданы с использованием PyMol (www.pymol.org).

Координаты и структурные факторы для UIApo, UIMn, TCCApo, TCCMn и STCMn * были депонированы в банк данных о белках по кодам присоединения 4E7H, 4E7I, 4E7J, 4E7K и 4E7L соответственно. Структурные факторы для UIApo-PO3, CIMn (аналогичные 3OY9) и STCMn (аналогичные 3OS0) будут доступны по запросу.

Мы благодарим д-ра А. Энгельмана, д-ра Ф. Дайду и д-ра М. Новотны за критическое чтение рукописи и д-ра С. Шумана (Институт Слоан Кеттеринг) за щедрый подарок экспрессионной конструкции PhoClp1 (Jain and Shuman, 2009). Эта работа финансировалась Британским советом по медицинским исследованиям грантом G1000917 и Национальным институтом охраны здоровья AI070042.

Вклад автора: SH и GNM выращивали кристаллы, собирали и обрабатывали данные дифракции рентгеновских лучей. SH анализировали в реакциях кристаллов путем денатурации PAGE. SH, GNM и ПК уточнили и проанализировали структуры и написали статью.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Ретровирусные интеграционные интермедиаты и обнаружение 3′-обработки и переноса нити в кристалле. (A) Схема комплексов IN-DNA, наблюдаемых в системах in vitro; тетрамер IN (голубой овал) собирается на концах вирусной ДНК, образуя интасом; этот начальный интасомный комплекс называется UI. В присутствии катионов Mg2 + или Mn2 + IN катализирует 3′-обработку, приводящую к CI. CI связывает целевую ДНК с образованием целевого захватного комплекса (TCC). STC представляет собой окончательное посткаталитическое состояние. Реактивные и нереактивные нити ДНК на каждом конце вирусной ДНК и ДНК-мишени показаны соответственно золотыми, оранжевыми и фиолетовыми линиями; стрелки представляют собой 3′-концы. Ингибиторы переноса струн связываются с активными сайтами CI и предотвращают образование TCC. Буквенные коды указывают на виды ДНК, наблюдаемые в кристаллах: N, 19-мерная нереактивная вирусная ДНК-цепь; r и R, 19-мерная необработанная и 17-мерная реакционная цепь соответственно; T, самодополнительные цепочки ДНК-мишени с 30 мерами; R + T и t, 34-мерные и 13-мерные переносные продукты соответственно. (B) Денатурировать анализ PAGE видов ДНК, выделенных из кристаллов UI, до (дорожка 3) или после вымачивания в присутствии Mn2 + (дорожки 4-9) или Mg2 + (дорожка 10). Время реакции указано выше изображения геля; основанный на относительных интенсивностях полос R и r, реакция составляла ~ 10, 20 и 50% после 20, 45 и 120 мин соответственно. 5′-маркированные N: r и N: R дуплексы были загружены в дорожки 1 и 2 соответственно. Размеры олигонуклеотидов субстрата и продукта указаны справа от геля. 5′-конец нереакционноспособной цепи блокировали нерадиоактивной фосфатной группой для улучшения обнаружения реактивной цепи во время маркировки без нарушения активного участка (дополнительный рисунок S2). (C) ДНК, выделенные из кристаллов TCC до (дорожка 7) или после инкубации в Mn2 + (дорожки 8-13) или Mg2 + (дорожка 14) в течение указанных периодов времени; на основе относительных интенсивностей T- и t-полос, реакция составляла ~ 30, 70, 90% после 30, 120 и 300 с соответственно. Дорожки 1-6 содержали t, S, T, N, R и отожженные образцы ДНК N: R соответственно. Обратите внимание, что хотя intasome не связывает ДНК-мишень специфично для последовательности, только симметричный комплекс кристаллизуется в используемых условиях (Maertens et al, 2010).

Общая архитектура ретровирусной интрасомы до 3′-обработки. (A) Структура UIMn просматривается в двух направлениях с цепями IN, показанными в режиме заполнения пробела (сверху) или в виде мультфильмов (внизу); внутренние субъединицы окрашены в темные голубые и зеленые, а внешние — серые. Реактивные и нереактивные вирусные нити ДНК изображены соответственно как желтые и оранжевые мультфильмы. Указываются местоположения активных сайтов (звездочек) и разреженных динуклеотидов. Обратите внимание, что кристаллизованная конструкция симметризирована наличием двух идентичных вирусных ДНК-концов, полученных из конца вирусной ДНК U5. Нативные комплексы ретровирусных нуклеопротеинов менее симметричны из-за различий в последовательности левого (U3) и правого (U5) вирусных ДНК-концов. В нативном PFV UI ожидается, что только конец ДНК U5 будет иметь разреженный динуклеотид, тогда как конец U3, естественно заканчивающийся на CA-последовательности, не подвергается 3′-обработке (Juretzek et al, 2004). (B) Измельчение конца вирусной ДНК до 3′-обработки. IN показан как мультфильмы (зеленые) с указанными элементами вторичной структуры; выбранные боковые цепи показаны в палочках. Реактивные и нереактивные вирусные нити ДНК показаны как желтые и оранжевые мультфильмы, соответственно, с указанием шести конечных нуклеотидов; серые сферы являются атомами Mn.

Активный сайт IN взаимодействует с не обработанным 3′-вирусным концом ДНК. (A) Стереофокус (настенный глаз) на 3′-конце вирусной ДНК в UIApo. Белок показан как полупрозрачная синяя поверхность, а ДНК — как палочная фигура с селезенкой с кремниевым фосфодиэфиром. Водородные связи между внутренним фосфодиэфиром рацевых динуклеотидов и аминов белковых спинов показаны как тире. (B) Стерео-представление активного сайта, связанного с необработанным 3′-концом вирусной ДНК, заканчивается и без Mn2 +. Углеродные атомы, принадлежащие структуре UIApo, окрашены в синий цвет, а те, что принадлежат UIMn, являются зелеными, а другие атомы соответствуют стандартной окраске: синий для азота, красный для кислорода и оранжевый для фосфора. Сферы представляют собой ионы марганца; черная стрелка указывает на перемещение кремниевого фосфодиэфира при связывании металла. (C) Стерео-представление активного сайта в структуре UIMn. Ионы металлов показаны в пурпурных и связанных молекулах воды красным цветом. Большая красная сфера указывает на то, что молекула воды готова действовать как нуклеофил в 3′-обработке, с потенциальным путем, обозначенным красной черточкой. (D) Межметаллические расстояния в разных структурах, причем металлы показаны как пурпурные сферы, углеводы белка в зеленом, вирусная ДНК в желтой и целевой ДНК в пурпурной.

Целевая ДНК-связывание и реакция переноса цепи. (A) Стерео-изображение целевой ДНК (пурпурного и пурпурного), наложенное на позицию реактивной вирусной ДНК-цепи перед обработкой (желтый) в TCCMn и UIMn соответственно. Целевые, восходящие и нисходящие фосфодиэфиры ДНК-мишени помечены черным цветом с «0», «-1» и «+1» соответственно; оснований реактивной вирусной ДНК-цепи, маркированной золотом. (B) Перемещение ДНК-фосфодиэфирной связи ДНК-мишени после переноса нити (черная стрелка).

Миметика субстрата с помощью ингибиторов переноса ВИЧ-инфекции. Активные сайты CI-структур, связанных с ингибитором (коды PDB 3OYA, 3OYB, 3OYH, 3OYG, 3S3M) были наложены на UIMn (верхний) или TCCMn (снизу) на основе атомов Cα остатков активного сайта. В стереовидениях ралтегравир (3OYA) показан как палочки с атомами углерода, окрашенными зеленым цветом и фтором в серый цвет; показаны только металлические хелатные атомы кислорода всех других ингибиторов переноса нитей (коричневые сферы). Белок показан как полупрозрачные мультфильмы; вирусной и целевой ДНК и выбранных остатков IN в виде полупрозрачных палочек. Ионы металлов из структур UIMn и TCCMn показаны серыми, а из структур, связанных с ингибитором, — зелеными. Про-S
p и мостиковые 3′-кислородные атомы фосфодиэфира (палочки) скрещивания или мишени, воды (WNuc) и 3′-гидроксильных нуклеофилов показаны как красные сферы. Изображения справа связаны с стереоизображениями с поворотом на 90 °, как указано. Водородные связи, обсуждаемые в тексте, показаны пунктирными линиями. Направление нуклеофильной атаки при 3′-обработке или переносе цепи обозначено розовой пунктирной линией. Химическая структура ралтегравира показана на рис. S4.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *