Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Распространенность антиретровирусных мутаций на резистентность к лекарственным средствам и подтипы ВИЧ-1 среди недавно диагностированных лиц, не получающих наркотики, в Центре добровольного тестирования и консультирования в северо-восточной части Южной Африки

Prevalence of Antiretroviral Drug Resistance Mutations and HIV-1 Subtypes among Newly-diagnosed Drug-naïve Persons Visiting a Voluntary Testing and Counselling Centre in Northeastern South Africa
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3190360/

Данные о антиретровирусной резистентности к лекарственным средствам среди лиц, не являющихся наркотиками, имеют важное значение для разработки политики дозорного эпиднадзора. Это исследование было проведено для определения распространенности мутаций, резистентных к антиретровирусной резистентности, среди лиц, инфицированных наркотиками, из числа ВИЧ-инфицированных лиц, посещающих добровольный центр тестирования и консультирования в больнице Манквинг в северо-восточной части Южной Африки. В общей сложности в феврале 2008 года по декабрь 2008 года были завербованы 79 ВИЧ-положительных лиц, не получавших наркотики, с помощью откалиброванного метода устойчивости к насекомым, доступного в базе данных по резистентности к наркотикам в Стэнфорде. Вирусную ДНК получали из 57 (72%) из 79 особей. Надежные нуклеотидные последовательности были получены для 54 участков обратной транскриптазы (RT) и 54 протеаз (PR) из 54 особей. В целом, пять последовательностей (9,3%) содержали мутации резистентности к лекарственным средствам (95% доверительный интервал -1,53-16,99). Четыре (7,4%) из них были мутациями ингибиторов нуклеозидного ОТ (D67G, D67E, T69D и T215Y), а одна (1,9%) была мутацией ингибитора PR (M46I). Не обнаружено никакой основной мутации нуклеозидной RT-устойчивости. В генах PR и RT наблюдались несколько незначительных мутаций устойчивости и полиморфизмов, характерных для подтипов C-вирусов. Филогенетический анализ парциальных последовательностей pol показал, что 52 (96%) из 54 изолятов были подтипом ВИЧ-1 C. Один изолят (08MB08ZA) был подтипом ВИЧ-1 B, а другой (08MB26ZA) был связан с подтипом HIV-1 J. Анализ рекомбинации подтипа ВИЧ-1 с помощью REGA присваивал последовательность pol подтип ВИЧ J (11_cpx) с начальной загрузкой 75%. Распространенность мутаций резистентности к лекарственным средствам, наблюдаемая в изученной популяции, была относительно выше, чем сообщалось ранее в других частях Южной Африки. Кроме того, это, по-видимому, первый отчет о J-подобном вирусе ВИЧ-1 из северо-восточной части Южной Африки.

Здоровье и качество жизни пациентов, инфицированных ВИЧ / СПИДом, значительно улучшились с момента введения в 1996 году высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ) (1,2). Однако одним из основных недостатков ВААРТ является развитие резистентности к лекарственным средствам, которое обычно сопровождает использование антиретровирусных препаратов (АРВ) (2,3). У лиц с лекарственной устойчивостью, обладающих резистентностью к АРВ-препаратам, существует относительно высокий риск вирусологической недостаточности, поскольку они начинают антиретровирусное лечение (АРТ) с более низким генетическим барьером на резистентность (4). Кроме того, укрывательство резистентных вирусов до начала лечения осложняет альтернативные алгоритмы лечения.

В развитых странах ВААРТ успешно используется, а лечение сопровождается регулярным вирусологическим мониторингом, включая измерение вирусной нагрузки и тестирование лекарственной устойчивости для руководства пациентами (5,6). С другой стороны, использование ВААРТ в условиях нехватки ресурсов по-прежнему создает множество проблем. Вирусологический мониторинг реже делается из-за привлечения затрат и нехватки квалифицированного персонала.

Южная Африка имеет одну из самых высоких показателей распространенности ВИЧ / СПИДа в мире, а в 2007 году в Южноафриканском национальном опросе по ВИЧ и сифилису было показано, что оценочная распространенность составила 28% (7), причем провинция Лимпопо (северо-восточная Южная Африка) имеет преобладание 20,7%. До 2004 года АРВ-препараты были доступны только через частные медицинские учреждения в Южной Африке, и из-за дефицита и непомерно высокой стоимости большинство пациентов не могли позволить себе лечение. В начале 2004 года была начата национальная программа доставки АРВ для предоставления лекарств тем, у кого было количество CD4 <200 клеток / мкл или с клинически определенным заболеванием. До 2010 года в соответствии с директивой по лекарственным средствам АРВ в Южной Африке было рекомендовано использование ставудина, ламивудина и эфавиренца (с заменой невирапина на эфавиренц для женщин детородного возраста). В настоящее время пересмотренный режим включает тенофовир, ламивудин и эфавиренц / невирапин. Ставудин по-прежнему рекомендуется, когда допускаются побочные эффекты (8).

Определение режима, основанного на профилях генетической резистентности вирусов пациентов до начала терапии, обычно коррелирует с лучшим результатом по сравнению с отсутствием данных резистентности (3,9). Информация о наличии устойчивых вирусов важна при составлении комбинированных схем или для принятия решения о том, следует ли назначать тестирование резистентности до начала терапии. По оценкам, к середине 2008 года 500 000 взрослых и детей получали АРВ-препараты в Южной Африке, причем около 34 000 из них находились в провинции Лимпопо (северная часть Южной Африки) (10). В Южной Африке в некоторых исследованиях отмечалось преобладание генетической резистентности к лекарственным средствам среди наивных популяций менее 5% (9,11). Однако, несмотря на низкую распространенность, важно следить за распространенностью резистентности к лекарственным средствам среди наименее распространенных людей, особенно в таких регионах, как северо-восток Южной Африки, где таких данных недостаточно. Единственные данные о резистентности, имеющиеся для северной части Южной Африки, были получены из образцов, собранных в 2001 году из района Уотерберг (10,12), до поступления АРВ через сектор общественного здравоохранения в 2004 году. Результаты этих исследований показали отсутствие мутаций резистентности в образцов. Кроме того, с 2004 года доступ к АРВ-препаратам вырос на севере Южной Африки (с 300 в 2001 году до 34 000 в 2008 году) (11), и важно рассмотреть вопрос о развитии резистентности к лекарственным средствам путем периодических исследований. Таким образом, целью этого исследования было предоставление базовых данных о мутациях резистентности к АРВ-препаратам в Манквинге (район Козерога), одной из областей, где АРТ впервые началось в северо-восточной части Южной Африки в 2004 году и где отсутствуют данные о резистентности. Полученная информация может быть полезна при разработке стратегий дозорного эпиднадзора в регионе.

Лица, не подвергшиеся предварительному АРВ-терапии, и которые тестировали положительный результат на ВИЧ-антитела в Центре добровольного тестирования и консультирования ВИЧ в больнице Манквинг, Южная Африка, были набраны последовательно в течение февраля 2008 года-декабря 2008 года. Вирусная нагрузка и количество лимфоцитов CD обычно не измерялись на клиника, и данные по ним были недоступны. Участники были, по-видимому, здоровыми людьми во время тестирования на ВИЧ. Больница Манквинг является частью больничного комплекса Polokwane-Mankweng, региональной референтной больницы провинции Лимпопо на севере Южной Африки. Центр добровольного тестирования и консультирования в больнице Манквинг обслуживает 19 медицинских центров в сельских районах Манквинг.

Пять мл венозной крови собирали в вакуумную трубку ЭДТА от каждого соглашающегося субъекта. Анкета использовалась для сбора демографических данных, таких как возраст, пол, место жительства, вероятная дата и место заражения и семейное положение. Большинство (87,3%) образцов обрабатывали для полной экстракции РНК в течение 48 часов при хранении при 4 ° C. Однако из-за транспортной логистики 10 образцов хранили при 4 ° С в течение четырех дней до изоляции РНК. Целую кровь центрифугировали при 3000 об / мин в течение трех минут. Плазму отсасывали асептически и хранили при -80 ° С для последующей экстракции РНК. Данные о вирусной нагрузке и количестве CD4 не были доступны.

Вирусную РНК выделяли с использованием набора вирусных мини-РНК (Qiagen, Hilden, Германия) и хранили при -80 ° C до использования. Два протокола использовали в разное время для амплификации гена полимеразы ВИЧ. В одном протоколе проводили однотрубную RT-полимеразную цепную реакцию (RT-PCR) с AMV RT (Roche, USA) и Taq-ДНК-полимеразой (Invitrogen) с последующей вставкой ПЦР, как описано выше (10). Это дало примерно 1,4-kb-продукт, содержащий весь PR и по меньшей мере 900 пар оснований RT-гена. В другом протоколе кДНК синтезировали с использованием системы Thermoscript RT-PCR (Invitrogen, Hilden, Germany). После этого фрагмент гена полимеразы 1,7 кб, содержащий весь PR и по меньшей мере 1200 п.о. гена RT, амплифицировали с использованием системы Expand Long Template System (Roche), как описано выше (11). Продукты ПЦР проверяли на ожидаемый размер путем электрофореза 1% агарозного геля, окрашенного бромидом этидия. ПЦР-ампликоны очищали с помощью набора QIAquick для ПЦР-очистки (Qiagen, Hilden, Germany), и на обеих нитях с набором BigDye Terminator v3.0 на ABI Prism 377 (Applied Biosystems) проводили прямое секвенирование на основе популяции с использованием ДНК-полимеразы Taq. Сгенерированные нуклеотидные последовательности редактировали вручную с использованием программного обеспечения SeqMan II (версия 7) (DNASTAR, Lasergene, США).

Подтипирование ВИЧ проводилось филогенетическим анализом. Последовательности полимеразы (880 пар оснований), содержащие полный PR и частичные RT-гены тестируемых вирусов, были выровнены с использованием ClustalX с репрезентативными последовательностями репрезентативных подтипов (подтипы группы M A-D, F-H, J и K, исключая рекомбинантные последовательности), полученные из GenBank (13). Ранее описанные последовательности из провинции Лимпопо были включены в анализ. Соседние филогенетические деревья были сформированы с помощью программы PHYLIP, что позволило использовать модель максимального правдоподобия для учета различий в коэффициентах перехода и трансверсии. Деревья были укоренены с штаммом HIV-1 группы O (L20571). Надежность деревьев оценивалась путем загрузки 1000 копий. Инструмент подтипирования REGA HIV-1 и 2 (версия 2.0) использовался для анализа последовательностей для рекомбинации (14,15). В инструменте используются филогенетический анализ и методы bootscanning для назначения генетических подтипов. Прогнозируемые аминокислоты генов PR и RT были выровнены с использованием программы BioEdit (16). Были созданы согласованные аминокислотные последовательности областей PR и RT, а затем сравнивались с глобальным подтипом C и глобальными подтипами B консенсусных последовательностей, полученными от GenBank (2000). Средние генетические расстояния между последовательностями PR и RT определялись моделью Kimura 2parameter.

Мутации резистентности к лекарственным средствам были исследованы в соответствии с методом откалиброванной резистентности к популяции (CPR) (версия 5.0), содержащимся в базе данных Стэнфордского лекарственного средства для борьбы с ВИЧ (http://cpr.stanford.edu/cpr/servlet/CPR). Инструмент СЛР анализирует представленные последовательности для резистентных мутаций на основе списка мутаций, связанных с передозировкой лекарственной устойчивости Всемирной организации здравоохранения (17). Инструмент также обнаруживает необычные, плохие и гипер мутированные последовательности и выполняет назначение подтипа.

Комитет по этике здоровья, безопасности и исследований Университета Венды, Южная Африка, утвердил протокол исследования. Провинциальный отдел здоровья Лимпопо и больница Манквинг разрешили провести исследование. Подписанное информированное согласие было получено от каждого участника исследования.

В общей сложности 79 пациентов с ВИЧ-положительными были последовательно завербованы для исследования. Их средний возраст составлял 38,5 (диапазон 18-59) лет. Доля женщин и мужчин составляла 73,4% и 25% соответственно. Около 80% субъектов исследования были одинокими, а 22,8% были женаты. Важнейшим фактором риска передачи ВИЧ на основе ответов на вопросник был половой акт (97,5%). Однако вопросник не был разработан, чтобы определить, является ли он гетеросексуальным или гомосексуальным. В 89,9% участников наиболее вероятным местом заражения ВИЧ была Южная Африка. Около 47% испытуемых были инфицированы в 2008 году, а остальные испытуемые оценивали, что они были инфицированы в 2000-2007 годах. Самый высокий уровень образования для 79,7% участников был 6-го и выше, но среди участников не было зарегистрировано ни одного выпускника университета. Подробная информация о демографических и социально-экономических характеристиках исследуемого населения приведена в таблице.

Вирусную ДНК получали для 57 (72%) из 79 особей. Надежные нуклеотидные последовательности были получены для 54 RT-генов и 54 PR-генов, на которых были проведены генетические анализы мутаций подтипов и лекарственной устойчивости. Используя CRP-анализ мутаций резистентности к лекарственным средствам, у 5 (9,3%) из 54 последовательностей были мутации, связанные с лекарственной устойчивостью (95% доверительный интервал -1,53-16,99). Они включали в себя четыре мутации NRTI (D67E, D67G, T69D и T215Y), унаследованные последовательностями 08MB38ZA, 08MB26ZA, 08MB27ZA и 08MB29ZA соответственно, и одну мутацию устойчивости к PI (M46I), наблюдаемую в последовательности 08MB62ZA. Мутации NNRTI не обнаружены, и никакая последовательность не содержит более одной мутации устойчивости.

Филогенетический анализ парциальных последовательностей pol показал, что 52 (96,3%) из 54 изолятов были подтипом ВИЧ-1 C. Один изолят (08MB08ZA) был подтипом ВИЧ-1 B, тогда как изоляция 08MB26ZA была связана с подтипом ВИЧ-1 J (рис.1). Анализ загрузочного сканирования 08MB26ZA с помощью инструмента подтипирования REGA HIV-1 показал, что его ген pol имеет мозаичную структуру и связан с CRF_11 (фиг.2). Функция генотипирования STAR с анализом CRP также назначала 08MB26ZA для CRF_11. Более того, этот образец укрывал единственную мутацию D67G NRTI, наблюдаемую в исследовании. Чистые подтипы были назначены во все остальные последовательности после анализа bootscanning. Среднее генетическое расстояние для PR-последовательностей составляло от 0,0239 до 0,2519 и 0,0273 до 0,1527 для последовательностей RT. Учитывая первые 300 аминокислот в гене RT, выравнивание последовательности показало, что консенсус тестовых вирусов идентичен консенсусу глобального подтипа C. Он отличался от глобального подтипа B консенсуса в 18 положениях (V35T, E36A, T39E, S48T, K122E, D123G, K173A, D177E, T200A, Q207E, R211K, V245Q, A272P, K277R, T286A, E291D, V292I и I293V). Аминокислотное выравнивание PR-гена показало, что консенсус теста был идентичен глобальному подтипу C консенсуса, за исключением положения T13I. Он отличался от глобального подтипа B консенсуса на восьми позициях (T12S, I15V, L19I, M36I, R41K, H69K, L89M и I93L).

Демографические и социально-экономические характеристики исследуемой популяции

Филогенетический анализ частичных последовательностей ВИЧ-инфекции у лиц, не получающих наркотики из северо-восточной части Южной Африки

Последовательности генов PR и RT, представленные здесь, были представлены в GenBank со следующими регистрационными номерами: PR: GU188807-GU188752; RT: GU188753-GU188806.

Развитие лекарственной устойчивости является важным атрибутом ВИЧ. Инфекция лекарственно-устойчивыми вирусами осложняет клиническое лечение пациентов. В связи с появлением устойчивых вирусов необходим надзор за лекарственно-устойчивыми вариантами среди населения, так как это может способствовать установлению дозорного эпиднадзора или генотипической резистентности перед началом терапии (3,8,17,18).

Назначение подтипа и анализ рекомбинации подтипа ВИЧ-1 от 08MB26ZA

Антиретровирусное лечение было начато в сообществе Манквинг в 2004 году, за четыре года до сбора образцов, в течение которого появляется возможность возникновения резистентности и передачи. Таким образом, целью настоящего исследования было определение распространенности мутаций, связанных с резистентностью к лекарственным средствам, у лиц с наименее развитыми лекарственными средствами в Манквинге, Южная Африка. Участниками исследования были люди, которые впервые «вошли» в Центр добровольного тестирования и консультирования по ВИЧ. Образцы крови собирали последовательно от людей, которые испытывали положительный результат. Мутации, связанные с резистентностью, были обнаружены у пяти из 54 проанализированных субъектов, что обусловило распространенность у пациентов с устойчивыми вирусами 9,3%. Были обнаружены только мутации NRTI и PI. Согласно классификации устойчивости ВОЗ, распространенность 9,3% умеренно высокая (5-15%). Кроме того, наблюдаемая распространенность также была относительно выше по сравнению с тем, что было ранее сообщено в других частях Южной Африки. Например, исследование эпиднадзора за резистентными мутациями у наивных лиц в провинции Гаутенг в 2002 и 2004 годах показало, что показатель распространенности 4,2% (9). В другом исследовании, проведенном в Кейптауне (провинция Западный Кейп), распространенность основных мутаций резистентности к лекарственным средствам у наивных пациентов составила 2,5% (11). Аналогичным образом, из Свободного государства сообщается о распространенности 3,6% (19). Низкие уровни (<5%) или отсутствие мутаций резистентности к лекарственным средствам были зарегистрированы в других южных африканских странах, таких как Замбия (20) и Малави (21). Распространенность, наблюдаемая в настоящем исследовании, сходна с тем, что сообщалось в некоторых странах с высоким уровнем дохода с более чем десятилетием использования АРТ. Некоторые из этих стран включают Великобританию, где зарегистрирован уровень сопротивления 14,2% (22) и Соединенные Штаты, где зарегистрировано до 25% (23). В отличие от стран с высоким доходом, низкая распространенность мутаций на резистентность к лекарственным средствам ожидалась в странах с низким доходом на ранней стадии лечения, поскольку большинство пациентов начали терапию на сильнодействующих режимах. В странах с высоким доходом применение АРТ началось с резистентной монотерапии и одноклассной терапии (24).

В настоящем исследовании все наблюдаемые мутации устойчивости были обнаружены у разных особей, причем 2008 год был вероятным годом заражения. Мутации в D67E, D67G и T69D были обнаружены у трех женщин, тогда как T215Y и M46I были обнаружены у двух мужчин. Было также обнаружено несколько полиморфизмов, таких как K20R, M36I и I93L, общие для вирусов подтипа HIV-1 и связанные с сайтом резистентности к лекарственным средствам, как сообщалось ранее (11). Согласно алгоритму лекарственной устойчивости ВОЗ, замещение D67E может вызывать резистентность к зидовудину, ставудину и диданозину на низком уровне, в то время как D67G вызывает резистентность к зидовудину на низком уровне, а также способность к низкоуровневой резистентности к абакавиру, ставудину и диданозин. В том же ключе T69D вызывает низкоуровневую резистентность к диданозину, с потенциалом для низкоуровневой резистентности к ставудину. Замещение T215Y вызывает промежуточное сопротивление зидовудину и ставудину и низкую устойчивость к абакавиру, диданозину и тенофовиру. Единственная наблюдаемая мутация ингибитора протеазы (PI) -M46I вызывает промежуточную резистентность к нелфинавиру, с потенциалом для низкоуровневой резистентности к дозозанимаемым ритонавиром дозам атазанавира, фосампренавира, индинавира и лопинавира.

Во время настоящего исследования рекомендуемым режимом первой линии был комбинированный режим ставудина, ламивудина и эфавиренца, при этом невирапин заменял эфавиренц для женщин детородного возраста. Схема, содержащая ПИ, использовалась для детей в возрасте менее трех лет и в режиме второй линии для взрослых (8).

Участники исследования заявили, что до начала исследования не лечились АРВ-препаратами. Большинство пациентов, получавших исследования, получат пользу от нынешней схемы лечения первой линии, основанной на их вирусных генетических профилях. Однако трудно предсказать распространение наблюдаемых мутаций и последствия для лечения на уровне популяции. Сопротивляющие мутации, описанные здесь, наблюдались после четырех лет доступности лечения в секторе общественного здравоохранения в районе исследования. Следует также отметить, что, хотя доступ к лечению в государственном секторе начался в 2004 году, АРВ-препараты были доступны через частный сектор до 2004 года, хотя и с более высокой стоимостью и ограниченным доступом. Признавая, что участники исследования не имели предварительного облучения АРВ-препаратами, мутации, возможно, были получены из переданных вирусов. Хотя участники, по-видимому, были здоровы, отсутствие вирусной нагрузки и измерение количества CD4 не позволяют хорошо оценить их иммунологическое и вирусологическое состояние. Мутации могут возобновляться со временем в отсутствие давления лекарственного средства, что приводит к возможной недооценке передаваемых резистентных вирусов. ДНК-амплификация не могла быть получена из приблизительно 25% образцов, вероятно, из-за очень низких вирусных нагрузок, поскольку большинство пациентов были бессимптомными. Последующие исследования по эпиднадзору необходимы для подтверждения результатов настоящего доклада и для сбора данных, относящихся к политике дозорного эпиднадзора и руководящим принципам лечения.

Идентификация вирусов подтипа C как преобладающего подтипа согласуется с результатами предыдущих исследований генотипирования в северной части Южной Африки (10,12). Тем не менее, наличие вирусов, связанных с подтипом B и CRF_11, ранее не сообщалось. Поскольку был проанализирован только частичный ген pol образца, подобный CRF_11, для выявления его полной мозаичной природы потребуется полноразмерный геномный анализ вируса.

Исследование было поддержано грантом на исследования, предоставленным Паскалю О. Бессону Национальным департаментом здравоохранения и Национальным исследовательским фондом Южной Африки. Разрешение на публикацию результатов было получено от Национального департамента здравоохранения. Авторы выражают благодарность доктору К. Кларку, д-ру С. Мавее и г-же Ханисе Соно из больницы Манквинг, Южная Африка, за вербовку пациентов. Приветствуется сотрудничество участников исследования.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *