Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Противовирусная активность альфа-спиральных сшитых пептидов, разработанных из домена димеризации капсида ВИЧ-1

Antiviral activity of α-helical stapled peptides designed from the HIV-1 capsid dimerization domain
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3097154/

C-концевой домен (CTD) капсида HIV-1 (CA), такой как CA полной длины, образует димеры в растворе, и димеризация CTD является основной движущей силой в процессе сборки и созревания Gag. Мутации остатков на димерном интерфейсе CTD ухудшают сбор вирусов и делают вирус неинфекционным. Таким образом, CTD представляет собой потенциальную цель для разработки препаратов против ВИЧ-1.

Из-за ключевой роли интерфейса димера мы предположили, что пептиды из α-спиральной области интерфейса димера могут быть эффективными в качестве ловушек для предотвращения образования димеров CTD. Однако эти небольшие пептиды не имеют какой-либо структуры в растворе, и они не проникают в клетки. Поэтому мы использовали метод сшивания углеводородов для стабилизации α-спиральной структуры и подтвердили конфокальной микроскопией, что эта модификация также сделала эти пептиды проникающими в клетки. Мы также подтвердили с помощью изотермической калориметрии титрования (ITC), равновесия осадконакопления и ЯМР, что эти пептиды действительно нарушают образование димеров. В тестах на сборку in vitro пептиды ингибировали образование частиц зрелого типа и специфически ингибировали продукцию ВИЧ-1 в клеточных анализах. Эти пептиды также проявляли сильную противовирусную активность против большой группы лабораторно адаптированных и первичных изолятов, включая вирусные штаммы, устойчивые к ингибиторам обратной транскриптазы и протеазы.

Эти предварительные данные служат основой для разработки небольших, стабильных альфа-спиральных пептидов и ингибиторов малых молекул, нацеленных на интерфейс димера CTD. Наблюдение, что относительно слабые связующие CA, такие как NYAD-201 и NYAD-202, проявляют специфичность и способны нарушать димер CTD, обнадеживает для дальнейшего изучения гораздо более широкого класса противовирусных соединений, нацеленных на CA. Мы не можем исключить возможность того, что описанные здесь пептиды на основе CA могут вызывать дополнительные эффекты на репликацию вируса, не связанные напрямую с их способностью связывать CA-CTD.

Во время сборки и морфогенеза ВИЧ-1 структурный белок Gag организуется в два совершенно разных устройства, незрелые и зрелые формы. В незрелой форме Gag остается нетронутым, тогда как в зрелой форме Gag расщепляется вирусной протеазой (PR). Образование этой зрелой частицы имеет важное значение для инфекционности ВИЧ-1, а капсидный белок (СА), полученный из продукта расщепления Gag, играет центральную роль в формировании конического вирионового ядра, которое окружает вирусный геном. Белок СА состоит из двух доменов, N-концевого домена (NTD, aa 1-145) и C-концевого домена (CTD, aa 151-231). Эти два домена связаны 5-аминокислотным линкером. Контакты CA-CA как у незрелых, так и зрелых частиц были смоделированы на основе рентгеновских структур изолированных доменов и реконструкций изображений путем криоэлектронной микроскопии зрелых вирионов и собранных вирусоподобных частиц (VLPs) [1-8]. Недавно была сообщена псевдоатомная модель полноразмерной гексамерной структуры CA-1 ВИЧ-1, которая предоставила структурные сведения о механизме действия некоторых известных сборочных ингибиторов [5,7,9]. CA ВИЧ-1 играет решающую роль в процессах сборки вирусов, созревания, а также ранних шагов после входа [1-4,6,8]. Мутации как NTD, так и CTD приводят к дефектам вирусной сборки и высвобождения [10-21]. В совокупности очевидно, что СА играет важную роль в сборе и созревании ВИЧ-1 и признана в качестве потенциальной цели для разработки нового поколения препаратов для лечения СПИДа [22-27].

NTD CA связывается с циклофилином A [28,29] и имеет важное значение для формирования вирусного ядра. Однако критические детерминанты олигомеризации Gag, необходимые для сборки вирусов, расположены в CTD [30]. Кроме того, CTD охватывает наиболее консервативный сегмент Gag, известный как основная область гомологии (MHR). Мутация ретровирусных CA MHR приводит к серьезным дефектам вирусной сборки, созревания и инфекционности [19, 31-37]. Выделенный CTD ВИЧ-1 CA, как полноразмерный CA, образует димер в растворе. Было показано, что димеризация CTD является основной движущей силой в сборке и созревании Gag [10,15]. Сообщалось о нескольких структурах димера CTD, обеспечивая критическую информацию о интерфейсе димера [38-41]. Мутация интерфейсных остатков в CTD-мономере нарушает образование димера [42], ухудшает сборку СА и устраняет инфекционную активность вируса [10,15]. Таким образом, CTD играет важную роль в сборе вируса и созревании и является потенциальной мишенью для разработки нового класса препаратов против ВИЧ-1 [6,43].

Белки-белковые взаимодействия играют ключевую роль в ряде биологических процессов, таких как взаимодействие антиген-антитело [44-46], вирусная сборка, запрограммированная гибель клеток, дифференцировка клеток и трансдукция сигнала. Таким образом, управление этими обширными массивами взаимодействий открывает возможности для разработки новых терапевтических агентов. Однако ингибирование этих процессов традиционными методами обнаружения лекарств может быть сложным и сложным из-за неглубоких интерфейсов связывания и относительно больших межфазных областей, участвующих в большинстве белок-белковых взаимодействий. До недавнего времени считалось практически невозможным ингибирование белково-белковых взаимодействий для достижения терапевтического эффекта. Однако это понятие теперь меняется из-за недавних достижений в этой области [45-50]. Кроме того, недавние исследования кристаллизованных комплексов антиген-антитело показали, что в посредничестве белково-белковых взаимодействий участвует лишь ограниченное количество остатков от каждого белкового партнера. Эти ограниченные области на интерфейсах связывания известны как «горячие точки», которые представляют собой небольшие участки ударов и отверстий, которые составляют большую часть свободной энергии связывания белкового интерфейса. Поэтому было установлено, что ингибиторы не должны блокировать всю поверхность связывания, но нацеливание на «горячие точки» может быть достаточным для ингибирования белково-белковых взаимодействий [51, 52].

Димерные белки представляют собой классический пример взаимодействия белок-белок через распознавание поверхности. Существует несколько примеров конкурентных ингибиторов димеризации белка, которые используют структуру интерфейсов белка. Например, показано, что межфазные пептиды ингибируют димеризат ВИЧ-1-интегразы, протеазы и обратной транскриптазы [53-56]. Однако ни один из этих пептидов не является клинически полезным из-за отсутствия проницаемости клеток. HIV-1 CA формирует димеры в растворе со скромным сродством (Kd = 18 мкМ). Интерфейс димера был отображен на CTD-спираль II различными способами, которые показывают значительную изменчивость в упаковке субъединицы [38,41,57,58]. Структура раствора, представленная Byeon et al. [57] показали значительные отличия от структуры (2BUO), о которой сообщает Ternois et al. [58] и 1A8O, сообщенные Gamble et al. [38], но аналогично структурам димера 1A43 и 1BAJ, описанным Worthylake et al. [41]. Поскольку димер CTD играет критическую роль в сборке ВИЧ-1, мы тщательно проанализировали рентгеновскую структуру димера CTD (коды PDB: 1a43) и выбрали короткий α-спиральный сегмент (aa 178-192) из ​​одного мономера в области интерфейса димера в качестве начальной точки для разработки ингибиторов. Эти пептиды могут конкурировать с одним мономером CTD и предотвращать димеризацию CTD. Самая большая проблема, с которой сталкиваются эти короткие пептиды, заключается в том, что они обычно неструктурированы в растворе и не проникают в клетки. Следовательно, они не могут использоваться клинически. Мы предположили, что скрепление углеводородов стабилизирует спиральную структуру коротких пептидов и сделает их проникающими в клетки, как это наблюдалось в случае пептидов NYAD-1 [59] и показано другими [60]. Кроме того, было показано, что короткие пептиды с углеводородным сшиванием являются жизнеспособными заменителями ингибиторов малых молекул, которые могут иметь большую площадь поверхности для связывания с относительно более плоской поверхностью связывания белка и обладают большим потенциалом в качестве будущих лекарств [60-63] , В этом исследовании мы сообщаем о рациональном проектировании таких пептидов (рис. 1), которые демонстрируют активность против ВИЧ-1. Данные, полученные в этом исследовании, могут заложить основу для разработки ингибиторов малых молекул, нацеленных на интерфейс димера CA.

Последовательности и первичная структура линейных и углеводородно-сшитых пептидов, указывающих места сшивания.

Мы использовали круговую дихроизмную спектроскопию для определения вторичных структурных характеристик пептида интерфейса сшитого димера, NYAD-201, его линейной производной NYAD-209 и мутантного аналога NYAD-201 (NYAD-233). В NYAD-233 ключевые остатки W184 и M185 в NYAD-201 были заменены аланином, как сообщалось [64]. Сшитые пептиды NYAD-201 и NYAD-233 показали типичные α-спиральные спектры с минимумами при 208 и 222 нм. Напротив, линейный пептид NYAD-209 показал два минимума при 200 и 218 нм (рис. 2), что указывает на то, что вторичная структура линейного пептида не принимает ни произвольной структуры, ни α-спиральной структуры. Недавно было обнаружено сходное наблюдение с линейным пептидом [65].

Исследование спектрального дихроизма (CD) спектроскопии NYAD-201, его линейного аналога NYAD-209 и двойного мутанта (W184A и M185A) NYAD-201 (NYAD-233) для определения их вторичной структуры. NYAD-201 и NYAD-233 показали характерные минимумы при 208 и 222 нм с указанием α-спиральной структуры, тогда как линейный аналог не показывал минимумов в этих областях.

Чтобы показать, что пептиды с надписью NYAD-201 и NYAD-233 проникают в клетки, мы исследовали клеточное поглощение FITC-конъюгированных NYAD-201 и NYAD-233 с помощью конфокальной микроскопии. Мы также использовали конъюгированный с FITC линейный пептид NYAD-209 в качестве контроля. Данные (рис. 3) показывают, что линейный пептид не проникает в клетки 293T, тогда как сшитые пептиды NYAD-201 и NYAD-233 (дополнительный файл 1, рис. S1) проникают в клетки.

Проникновение клеток NYAD-201 и его линейного аналога NYAD-209 в клетках 293T. Конфокальные микроскопические изображения клеток 293Т, инкубированные в течение 20 часов при 37 ° С с конъюгированными с FITC пептидами. Верхняя панель: изображение слева, контрастность контрастности (DIC) клеток с FITC-β-Ala-NYAD-209; Центр, флуоресцентное изображение FITC тех же клеток с FITC-β-Ala-NYAD-209; и Right, Overlay of DIC и флуоресцентные изображения FITC. Нижняя панель: слева, изображение DIC клеток с FITC-β-Ala-NYAD-201; Центр, флуоресцентное изображение FITC тех же клеток с FITC-β-Ala-NYAD-201; и Right, Overlay of DIC и флуоресцентные изображения FITC. В каждом лечении оценивали 200 клеток с помощью FITC-β-Ala-NYAD-209 или FITC-β-Ala-NYAD-201. Процент клеток в популяции, которые демонстрировали внутреннее окрашивание, показан в правом нижнем углу средней панели.

Влияние пептидов интерфейса димера на диссоциацию ЦД ЦТ было исследовано двумя независимыми биофизическими методами, изотермической титровальной калориметрией и аналитическим центрифугированием.

Влияние пептида интерфейса димера, NYAD-203, растворимого аналога NYAD-201, на диссоциацию димера, впервые исследовали с помощью изотермической калориметрии титрования (ITC). Разбавление CTD путем последовательных инъекций ITC в буфер, pH 7,3, 30 ° C, дало серию эндотермических тепловых импульсов (рис. 4), согласующихся с диссоциацией белковых олигомеров, моделируемых как димеры, с константой диссоциации димера (Kdiss) ~ 15 мкМ и диссоциацией энтальпия (ΔHdiss) 10,7 ккал моль-1. Аналогичные результаты были получены в присутствии сшитого пептида, но с постепенным увеличением Kdiss с увеличением концентрации пептидов (таблица 1). МТЦ неустановленного контрольного пептида (NYAD-401, Seq: IRQGPKEPFRDYVDR) не проявлял видимого теплового эффекта, подтверждая вывод о том, что связывание является значимым только для сшитых пептидов в этих условиях. Эти результаты качественно согласуются с гипотезой о том, что сшитые пептиды конкурируют с CTD-мономером и ингибируют димеризацию. Для такого механизма кажущая константа диссоциации димера должна зависеть от концентрации свободного пептида (ингибитора) ([I]) и аффинности связывания (KI) следующим образом:

Данные МТЦ для последовательного разведения 10 мкл аликвоты CTD (приблизительно 250 мкМ) в буфер при 30 ° C. Верхняя панель: исходные данные, сравнивающие эффекты эндотермического разведения в присутствии и отсутствии пептида (NYAD-203). Нижняя панель: интегрированные теплоты и теоретические приемы для разбавления только CTD (черный квадрат) или в присутствии 50 (белый квадрат), 200 (черный круг) или 350 (белый круг) μM пептидный ингибитор. Линии являются теоретически подходящими для димерной модели диссоциации с использованием параметров, перечисленных в таблице 1. Вставка: Концентрационная зависимость кажущейся постоянной сродства пептида, KI, приложение. Линейная экстраполяция до нулевой концентрации дает оценку KI = 45 (± 5) мкМ для связывания пептида с CTD в отсутствие пептидной самоассоциации.

Видимые термодинамические параметры для диссоциации димеров CTD, определяемые с помощью экспериментов по разбавлению ITC при 30 ° C в присутствии сшитого пептида NYAD-203 с концентрацией CI

* fm — оценочная доля CTD, встречающаяся в виде мономеров в растворе в этих условиях, рассчитанная по равновесным выражениям мономера-димера.

или приблизительная форма, которая может быть действительной при высоких концентрациях ингибитора:

где Ci — общая концентрация ингибитора пептидов в смеси. Этот анализ, однако, еще более усложняется очевидной самоассоциацией пептида (см. Раздел ЯМР), который снижает доступность свободного мономера (нижнего [I]) при более высоких концентрациях и, таким образом, приводит к недооценке аффинности пептидного связывания и зависимости концентрации кажущегося Ки. Однако, используя приведенные выше уравнения и экстраполяцию до низких концентраций, мы получаем значение Ki = 40 (± 5) мкМ для связывания мономера сшитого пептида (NYAD-203) с CTD в этих условиях. Это значение Ki несколько выше, хотя и сопоставимо по величине с константой димеризации самосогласования CTD, тем самым подтверждая первичную гипотезу о том, что свободная энергия взаимодействия субъединиц доминирует в этой области пептида.

Влияние NYAD-203 на диссоциацию димера CA также оценивали аналитическим ультрацентрифугированием. Для характеристики димеризации СА использовались комбинированные скорости осаждения и равновесные подходы.

В первом наборе экспериментов только СА и СА с различными соотношениями NYAD-203 анализировали центрифугированием скорости осаждения. Только СА (30 мкМ) дал единственный симметричный пик (данные не показаны). CA (30 мкМ) с различными отношениями NYAD-203 (CA: NYAD-203 = 1: 1 или 1: 3) также дало один симметричный пик (данные не показаны).

Во втором наборе экспериментов возможное влияние NYAD-203 на стабильность димера было проанализировано равновесным осаждением. Как показано на фиг.5, определяли кажущуюся молекулярную массу для СА в отсутствие или в присутствии различных соотношений NYAD-203. Только СА (30 мкМ) дает кажущуюся молекулярную массу 41 213 дальтон. CA: NYAD-203 при молярном соотношении 1: 1 дает кажущуюся молекулярную массу 30343 Да и при соотношении 1: 3 дает кажущуюся молекулярную массу 27 338 дальтон.

Анализ равновесного осадконакопления NYAD-203 на CA. Данные собирали при 20 000 об / мин, 25 ° С и рН 7,3, используя аналитическое ультрацентрифугирование Beckman XL-A / XL-I. Концентрацию CA фиксировали при 30 мкМ. (A, B & C). Разность остатков между установленной кривой и экспериментальными данными и (A1, B1 & C1). График абсорбции при 280 нм по сравнению с центробежным радиусом в отсутствие (контроль) или наличие 30 мкМ и 90 мкМ NYAD-203, соответственно. Открытые кружки представляют экспериментальные данные, а сплошные линии лучше всего подходят с использованием идеальной одновидовой модели.

Теоретически наблюдаемое уменьшение кажущейся молекулярной массы могло быть обусловлено установлением быстрорадикального равновесия диссоциации мономера-димера. Поэтому данные указывают на сдвиг в равновесии ассоциации-диссоциации, свидетельствующий о повышенной диссоциации мономера в присутствии более высоких доз NYAD-203.

При очень низких концентрациях CTD (<10 мкМ) белок преимущественно мономерный (> 90%), а при связывании с пептидом структурные возмущения индуцируют изменения химического сдвига в алифатических резонансах, за которыми следуют спектры HSQC 1H-13C, показанные на рисунке 6. Характерной особенностью димерного интерфейса CTD в растворе является общая изменчивость Helix II, источника значительного обменного уширения резонансов от остатков, расположенных в Helix II на границе димера [66]. Хотя избирательная потеря сигналов ЯМР от Helix II ограничивала доступную информацию для картирования точного сайта связывания пептида, мы наблюдали изменения концентрации химического сдвига в зависимости от концентрации в другом месте в гидрофобном ядре белка (рис. 6B). Степень возмущения химического сдвига настоятельно предполагает реорганизацию структуры спирального ядра CTD при образовании комплекса с пептидом. На рис. 6C резонансы от Leu190 Cδ1 / Hδ1 и Lys199 Cα / Hα (дополнительный файл 2, рис. S2) представлены в каждом из двух поперечных пиков вместо одного пика в спектрах HSQC 1H-13C. Дифференциальные интенсивности двух пиков взвешены по весу, соответствующие свободному и связанному состояниям соответственно. Аналогичные взвешенные по массе кросс-пики в «медленном режиме обмена» шкалы времени ЯМР наблюдались через титрование в другом месте белка. Как и ожидалось, при увеличении концентрации пептида до 25 мкМ интенсивность поперечного пика Leu190 Cδ2 в связанной фракции CTD увеличивается до 100% (фиг. 6A), но удивительно уменьшается при более высоких концентрациях пептидов (фиг. 6C). Структурная характеристика выделенного пептида NYAD-203 с помощью ЯМР показала спиральную структуру для остатков 3-14, которая самосогласовывается с образованием полимерных видов (фиг. S2). Четырехкратный избыток пептида, необходимый для насыщения 7 мкМ CTD, дает аффинность связывания менее 10 мкМ. Сродство NYAD-203 для мономерного CTD при низких концентрациях, по-видимому, выше по сравнению со значением 40 мкМ, полученным в экспериментах ITC. Весьма вероятно, что при повышенных концентрациях пептидов и белков, используемых в этих экспериментах, самоассоциация доминирует и в какой-то степени конкурирует с взаимодействием между пептидом и белком.

Спектры HSQC 1H-13C CTD в комплексе с пептидом NYAD-203. (A) В панели показана метильная область свободного и пептидного (25 мкМ) комплексообразованного [U C13, N15] CTD из спектров HSQC 1H-13C. (B) остатки CTD, нарушенные при связывании с пептидом и которые могут быть однозначно заданы, аннотируются (жирным / черным) в структуре. (C) Населенные взвешенные изменения интенсивности пика Cδ2 Leu190 из CTD в свободном и связанном состояниях при четырех концентрациях пептидов.

Чтобы исследовать, нарушает ли NYAD-201 сборку ВИЧ-1 в культуре клеток, мы трансфицировали 293T клетки полноразмерным молекулярным клоном ВИЧ-1 pNL4-3 и через 5 ч после трансфекции, обработанной различными концентрациями NYAD-201 для 18-20 час Затем клетки метаболически мечеными в течение 2 ч с помощью [35S] Met-Cys, а меченые вирусные белки в лизатах клеток и вирионов иммунопреципитировали ВИЧ-Ig и анализировали с помощью SDS-PAGE с последующей флюорографией [67]. Как показано на фиг.7А, эффективность высвобождения ВИЧ-1 снижалась зависимым от концентрации образом; с 50 мкМ NYAD-201 в 3 раза снижалось выделение вируса. В качестве контроля мы также включили пептид NYAD-233, в котором остатки интерфейса димера ключа «WM» в NYAD-201 были изменены на Ala-Ala (рисунок 1). Никакого дефекта эффективности высвобождения вируса не наблюдалось с контрольным пептидом NYAD-233 (рисунок 7A). Чтобы проверить, является ли ингибирование высвобождения вируса, опосредованного NYAD-201, специфичным для ВИЧ-1, мы протестировали действие этого пептида на высвобождение другого вируса инфекционной анемии вируса ленивируса (EIAV) в 293T клетках. Интересно отметить, что высвобождение частиц EIAV не ухудшалось NYAD-201 (рисунок 7B), что указывает на то, что ингибирующее действие NYAD-201 на образование частиц ВИЧ-1 не было результатом неспецифических эффектов, таких как цитотоксичность. Чтобы рассмотреть возможность того, что разница в чувствительности ВИЧ-1 против EIAV к NYAD-201 была результатом обработки Gag PR (для ВИЧ-1 на рисунке 7A) или не обрабатывается (для EIAV на рисунке 7B) мы параллельно тестировали вектор экспрессии вектора HIV-1 Gag с промотором CMV. Опять же, мы заметили, что производство VLP ВИЧ-1 было умеренно сокращено, тогда как производство частиц EIAV не было затронуто (рисунок 7B). Вместе эти результаты показывают, что связывание NYAD-201 с CA CTD скромно, но специфически препятствует производству частиц ВИЧ-1 в клетках.

NYAD-201 ингибирует образование частиц ВИЧ-1, но не EIAV. (A) 293T клетки трансфицировали pNL4-3 и через 5 ч после трансфекции, обработанной указанными концентрациями NYAD-201 или NYAD-233 в течение 18 часов. Затем клетки метаболически помечены [35S] Met / Cys в течение 2 часов. Клетки лизировали и вирионы собирали ультрацентрифугированием. Клеточные и вирусные лизаты иммунопреципитировали ВИЧ-Ig и подвергали SDS-PAGE; белковые полосы количественно определяли путем анализа фосфоримагером. Эффективность высвобождения ВИЧ-1 рассчитывали как количество связанного с вирионом p24 относительно общего (клеточного + вириона) Gag. (B) 293T клетки трансфецировали векторами, управляемыми CMV, экспрессирующими EIAV (pPRE-Gag) или HIV-1 (pCMVdeltaR8.2 / PR-) Gag и обрабатывали NYAD-201 при указанных концентрациях. Через 18 ч клетки, обработанные пептидом, метаболически помечены [35S] Met / Cys в течение 2 ч (ВИЧ-1) или 5 ч (EIAV) и иммунопреципитированы антисывороткой ВИЧ-Ig или анти-EIAV. Эффективность высвобождения рассчитывали как количество вириона, связанного с Pr55Gag, с общим Pr55Gag в клетках и вирионах. Значения Р рассчитывались по t-критерию Стьюдента, причем P <0,01 считалось значимым. N = 3, ± SD.

Чтобы определить, разрушает ли NYAD-201 сборку как незрелых, так и зрелых частиц, мы создали два сборника in vitro [59]. Мы использовали полноразмерные белки Gag для образования сферических незрелых частиц. Влияние ингибиторов на сборку незрелых частиц изучали путем проведения сборочных реакций в присутствии различных доз NYAD-201.

NYAD-201 не смогла сорвать образование незрелых частиц даже при молярной эквивалентной дозе (данные не показаны). Для зрелых частиц мы получили трубчатые частицы из очищенного СА [3,68], которые при воздействии на NYAD-201 показали явный эффект доза-эффект (рис. 8А и 8В). При даже 0,25-кратном молярном эквиваленте NYAD-201 наблюдалось существенное нарушение частиц в форме трубки. Полное нарушение было достигнуто при молярном эквиваленте и более высоких дозах (рис. 8А и 8В). NYAD-233, мутантный сшитый пептид, лишенный ключевого мотив «WM» (рис. 1), не смог сорвать зрелые частицы даже при 3-кратной молярной эквивалентной дозе (рис. 8C). Скремблированный пептид с углеводородным сшиванием, NYAD-215, не оказывал никакого влияния на образование зрелых частиц (данные не показаны). Обоснованием использования CA вместо CANC для образования зрелых частиц было подтверждение того, что NYAD-201 нацеливает только CA [59].

Ингибирование in vitro сборки NYAD-201. (A) Отрицательно окрашенные EM-изображения зрелых частиц, полученные в результате сборки in vitro белков СА в присутствии пептида (контрольного), 0,25-, 0,5-, 1,0-, 3,0- и 5-кратного молярного эквивалента NYAD- 201. (B) Эффект доза-эффект NYAD-201 на образование зрелой частицы, подобной трубке. (C) Сбор in vitro белков СА в присутствии пептида (контрольного) и 3-кратного молярного эквивалента NYAD-233.

Мы использовали человеческие клетки SupT1, инкубированные с мечеными GFP-Vpr-мечеными вирусами ВИЧ-1 в присутствии NYAD-201 или пептидного ингибитора слияния ВИЧ-1 T-20 (энфувиртид) в качестве контроля для оценки проникновения вируса (данные не показано). Т-20 является первым клинически используемым препаратом на основе пептидов, предназначенным для ингибирования введения ВИЧ-1 [69-72]. Анализ флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS) показал, что 36%, 41% и 38% клеток SupT1 были GFP + при 50 мкМ, 25 мкМ или 12,5 мкМ NYAD-201 соответственно, аналогично наблюдаемым уровням (35%) в отсутствие NYAD-201. Напротив, Т-20 при 111 нМ существенно ингибировал проникновение вируса. Способность T-20 значительно уменьшить сигнал GFP + сильно утверждает, что сигнал получен из частиц, которые вошли в ячейку, а не из тех, которые остаются связанными с поверхностью ячейки.

Поскольку NYAD-201 является CA-связывающим пептидом, и его взаимодействие с CTD ингибирует образование вирусного ядра, мы проверили, может ли NYAD-201 ингибировать инфекционную активность вириона. С этой целью мы провели однотактные анализы инфекционности в индикаторной клеточной линии TZM-bl [73, 74]. Анализы проводили в нескольких разных условиях (рисунок 9). Вирус-продуцирующие клетки инкубировали с 12,5, 25 и 50 мкМ NYAD-201 в течение двух или четырех дней и собирали выделенные вирионы. RT-нормированные вирусные запасы использовались для инфицирования клеток TZM-bl. Как показано на фиг.9А, вирионы, полученные из клеток, обработанных в течение четырех дней NYAD-201, показали двукратное снижение инфекционности. Отметим, что пептид из супернатанта продуцирующей клетки разбавляли в 30 раз в анализе инфекционной активности TZM-bl (см. Рис. 9). Кроме того, концентрация активного пептида в среде после двух или четырех дней в культуре, вероятно, будет значительно ниже, чем концентрация, добавленная первоначально. Мы также лечили вирусы NYAD-201 до заражения, обрабатывали клетки-мишени до или после заражения или обрабатывали пептидом в течение двухчасового периода инфекции. Интересно, что лечение вирионов или клеток-мишеней до заражения уменьшало зараженность в два-три раза; однако, если пептид присутствовал в течение двухчасового периода инфекции, ингибирование было более тяжелым (5-6 раз). Обработка постинфекции клеток налагала скромный (двукратный) дефект в инфекционной активности вириона (рис. 9B). В качестве контроля этих анализов инфекционности мы использовали контрольный пептид NYAD-233 (рисунок 1). Опять же, пептид NYAD-201 ингибировал вирусную инфективность в> 5 раз, когда он присутствовал в течение двухчасового периода заражения, тогда как NYAD-233 не влиял на инфекционную активность частиц (рис. 9C).

NYAD-201 ингибирует инфекционность ВИЧ-1. (A) Через пять часов после трансфекции клетками pNL4-3, 293T обрабатывали 12,5, 25 и 50 мкМ NYAD-201 в течение 2 или 4 дней и супернатант собирали и контролировали для активности RT. Для инфицирования клеток TZM-bl в течение 2 ч в общем объеме 200 мкл использовали примерно 7 мкл RT-нормированных вирусных запасов. Такой подход привел к разбавлению концентрации пептида из супернатанта продуцирующей клетки в 30 раз. Через два дня после инфицирования клетки промывали, лизировали и анализировали на активность люциферазы. (B) Клетки или вирионы обрабатывали 5, 20 или 50 мкМ NYAD-201 до, во время или после заражения, как описано в Методах. Инфекцию клеток TZM-bl проводили в течение 2 ч и через два дня после того, как инфицирующие клетки промывали, лизировали и анализировали на активность люциферазы. (C) NYAD-201 или NYAD-233 добавляли к клеткам TZM-bl при указанных концентрациях в течение 2-часовой инфекции. Через два дня после того, как инфицированные клетки были промыты и активность люциферазы была измерена, так как в винионах A (D) ВИЧ-1 были псевдотипированы VSV-G путем котрансфекции Env-дефектного pNL4-3-производного (pNL4-3 / KFS) с помощью VSV- G экспрессирующий вектор pHCMV-G. RT-нормированные WT и VSV-G псевдотипированные вирионы использовали для инфицирования клеток TZM-bl в присутствии указанных концентраций NYAD-201 в течение 2 часов. Через два дня после инфицирования активность люциферазы измеряли в клеточных лизатах. N = 4 для A, B, D; n = 3 для C; ± SD.

Эти результаты свидетельствуют о том, что в дополнение к ингибированию сборки и созревания вирионов, NYAD-201 может также влиять на вход и / или ранний шаг после вхождения в цикл репликации. Чтобы более подробно изучить эту проблему, мы проверили, могут ли псевдовизуальные вирионы с VSV-G обходить блок заражения. TZM-bl клетки были инфицированы VSV-G-псевдотипированным NL4-3 в присутствии NYAD-201. Интригующе, инфекционность VSV-G-псевдотипированного ВИЧ-1 в этих условиях не ингибировалась (рис. 9D). Этот зависящий от Env эффект указывает на то, что дефект зараженности, налагаемый NYAD-201, может быть отменен путем изменения пути проникновения вируса. Важно отметить, что в литературе имеется прецедент для того, чтобы CA-зависимый дефект в сборке ядра был обратимым с помощью псевдотипирования VSV-G [75].

Мы измерили активность HIV-1 NYAD-201 и его аналогов (рис. 1) в анализе на основе клеток с использованием нескольких лабораторно-адаптированных и первичных изолятов в клетках MT-2 и PBMC соответственно. Ингибирование продуцирования р24 в клетках МТ-2 измеряли в диапазоне концентраций и рассчитывали концентрацию, необходимую для ингибирования 50% (IC50) продуцирования р24. Результаты, приведенные в таблице 2, показывают, что NYAD-201 и его аналоги эффективно ингибируют широкий спектр штаммов ВИЧ-1, представляющих разные подтипы, которые используют корецепторы R5, X4 или R5X4, включая один устойчивый к Х4-тропическому RT-ингибитору (AZT-R ) и один устойчивый к Х4-тропическому PR-ингибитору штамм. Сшитые пептиды ингибировали лабораторные штаммы с низкой μM-активностью (IC50 ~ 3-6 мкМ), и оба R5- и X4-тропических вируса были ингибированы с аналогичной эффективностью. Мы также тестировали линейный пептид и два контрольных пептида с углеводородным сшиванием, NYAD-215 и NYAD-233. Ни один из этих пептидов не проявлял никакой противовирусной активности даже при дозе 100 мкМ (данные не показаны).

Противовирусная активность (IC50) и цитотоксичность (CC50) NYAD-201, NYAD-202 и NYAD-203 в лабораторно адаптированных и первичных изолятах ВИЧ-1

Мы также протестировали ингибирование NYAD-201 и его аналогов против группы первичных изолятов ВИЧ-1 в PBMC, представляющих в основном группу M (подтипы от A до G) с различным использованием корецепторов. Пептиды проявляли ингибирование всех тестируемых первичных изолятов, включая один из группы О. Эти пептиды проявляли сходную ингибирующую активность в отношении этого разнообразного диапазона первичных изолятов, за исключением штамма группы О, который демонстрировал несколько сниженное ингибирование, указывая на его эффективность в отношении широкого спектра ВИЧ -1.

Цитотоксичность сшитых пептидов оценивали по методу XTT как в клетках МТ-2, так и в РВМС. Анализы цитотоксичности проводились параллельно с анализами ингибирования ВИЧ-1. CC50 (концентрация ингибитора, необходимая для получения 50% цитотоксичности), значения NYAD-201 в клетках MT-2 и PBMC составляли> 115 мкМ. NYAD-202 более цитотоксичен в клетках MT-2 (30), чем в PBMC (> 116 мкМ). Однако NYAD-203 был цитотоксичным, как это было отмечено ранее для NYAD-13 [59].

В этом исследовании мы описываем рациональный дизайн ингибиторов на основе пептидов, полученных из домена димеризации CA-1 ВИЧ-1. Этот подход основан на гипотезе о том, что эти пептиды будут действовать как приманки и связываться с мономерным СА, тем самым предотвращая образование димера CTD, что является критическим этапом сборки вируса и созревания. Мы выбрали линейный отрезок пятнадцати вычетов из интерфейса димера (a 178-232) для разработки приманки на основе димерной структуры ВИЧ-1 CA, а также биофизические исследования пептида интерфейса димера CAC1, который, как было показано, образует гетерокомплекса с CA CTD с кажущейся константой диссоциации 50 мкМ [65]. Однако хорошо известно, что пептиды такой короткой длины, как правило, существуют как случайные структуры, несмотря на то, что вторичная и третичная структуры этого сегмента в белке CTD являются α-спиральными. Поскольку α-спиральная структура имеет решающее значение для образования димеров, мы использовали метод сшивания углеводородов [60,61,76,77] для стабилизации α-спиральной структуры этого короткого пептида. Мы выбрали остатки 183 (i) и 187 (i + 4) α-спирального сегмента для сшивания, поскольку они расположены централизованно напротив границы димера и, как ожидается, не будут мешать связыванию этого модифицированного сшитого пептида с мономером CTD. Мы дополнительно модифицировали другие остатки на N- и С-концах на основе термодинамического анализа диссекции интерфейса димера [78], который показал, что мутация некоторых остатков усиливает константу ассоциации. По-видимому, димер CTD должен иметь слабую связь из-за других критических функций, где мономеры могут играть важную роль; однако для разработки эффективных ингибиторов из пептида интерфейса димера нам необходимо реконструировать короткие пептиды с повышенной аффинностью связывания в отношении мономера CTD. Исходя из этого требования, мы синтезировали NYAD-201, NYAD-202 и NYAD-203, растворимый аналог NYAD-201. Мы также синтезировали линейный аналог NYAD-201 (NYAD-209) и мутантный аналог NYAD-201 (NYAD-233) после мутации двух ключевых остатков димерных интерфейсов W184A и M185A. CD-анализ подтвердил, что NYAD-201 и мутантный сшитый пептид NYAD-233 имеют характерный спиральный спектр, тогда как линейный аналог NYAD-209 не показал α-спиральности. Поскольку сбор и образование вирусных частиц являются внутриклеточными событиями, эти пептиды должны проникать в клетки, чтобы оказывать их действие, предотвращая образование димера и тем самым препятствуя образованию частиц. Хотя механизм проникновения клеток не ясно понят, эти сшитые пептиды проникают в клетки, как описано для аналогичных пеллет сшитых пептидов [60,61,79]. Модифицированные пептиды, за исключением мутантного пептида NYAD-233, ингибировали образование частиц in vitro. Эти результаты подтверждают структурную модель, согласно которой расслабленный димер может создавать незрелые частицы; однако крайне важно достичь компактной конфигурации CTD с образованием зрелых частиц [80]. Это открытие указывает на то, что ингибиторы на основе пептидов, нацеленные на разные сайты на СТД, как описано в этом исследовании, а также в нашем предыдущем докладе [59], могут обеспечить механистическое понимание процесса сборки и созревания вируса и могут помочь в выяснении структурных требования к формированию незрелых и зрелых вирусных частиц.

Мы наблюдаем, что NYAD-201 оказывает умеренное влияние на производство частиц ВИЧ-1. Обнаружение того, что этот пептид не ингибирует продуцирование VLP EIAV и что контрольный пептид NYAD-233 не влияет ни на продуцирование частиц ВИЧ-1, ни на EIAV, указывает на то, что этот эффект специфичен для интерфейса димера CA-CTD ВИЧ-1. Однако в настоящее время механизм действия NYAD-201 в отношении формирования VLP не ясен. Сокращение производства частиц может быть связано с воздействием на различные аспекты функции Гэга (например, устойчивость к гагу, торговля людьми и т. Д.), А не для нарушения незрелой сборки как таковой.

Мы использовали центробежное центрирование ITC и осаждения, чтобы измерить влияние этих сшитых пептидов на диссоциацию димера CTD. Повышенная диссоциация димера CTD в присутствии постепенно возрастающих концентраций сшитого пептида была косвенной мерой ингибирующей активности МТЦ. Несмотря на то, что NYAD-203, растворимый аналог NYAD-201, соответствовал димерной модели диссоциации, влияние на диссоциацию было скромным. Эти данные контрастируют с сильным ингибированием этими пептидами в противовирусных анализах. Аналогичные расхождения были отмечены с помощью CAP-1, CA-NTD-целевого соединения [81]. Вероятным объяснением этих результатов является то, что локальная концентрация Gag намного выше (14 мМ) [81] в плотно упакованной решетке зрелой частицы, тем самым гарантируя, что связанный пептид насыщает часть доступных сайтов. Следовательно, относительно низкое сродство пептида не уменьшает его активность по отношению к зрелой вирусной частице в той же степени, что мы наблюдаем ограниченное влияние на диссоциацию CTD в растворе.

Характерной особенностью димерного интерфейса CTD в растворе является общая гибкость Helix II, предлагаемая для облегчения перегруппировки молекул Gag через различные стадии сборки зрелых частиц [82]. В предыдущих исследованиях установлено, что мутантный CTD может существовать как стабильный мономер и заметно похож на субъединицы нативной димерной структуры [64]. Стабильность мономерной структуры тогда не плотно связана с димеризацией и может существовать как независимый домен, не разворачиваясь полностью [83,84]. Мономерный CTD-мутант (W184A / M185A) имеет гидрофобный карман на дистальной стороне границы димера, известный как связывающий пептиды [85], но в этом случае не имеет измеримого сродства к NYAD-203 (данные не показаны). Поэтому мы выдвигаем гипотезу, что сшитый пептид NYAD-203, структурный мимик спирали II, взаимодействует с кратковременно открытой спиралью II на границе димера динамическим механизмом. Пептид вряд ли благоприятствует режиму единственного связывания, и данные о динамическом обмене между конформационными состояниями наблюдаются за счет чрезмерного уширения и / или наличия множества сложных пиков через титрование с помощью ЯМР. Предварительный анализ данных ЯМР предполагает, что структура СТД, образованная в комплексе с пептидом, подвергается конформационному изменению в сердцевине упаковки гидрофобных остатков. Несмотря на скромное сродство к пептиду, частичная потеря интерфейса димера CTD и тонкие изменения в структуре мономеров молекул Gag, как ожидается, нарушают и препятствуют сборке капсидной частицы. В отличие от биофизических и ЯМР-данных в поддержку прямого взаимодействия между пептидом и CTD, in vitro гомологичный пептид NYAD-201, по-видимому, не влияет на незрелые частицы, а только разрушает зрелые частицы. Возможное объяснение этого наблюдения можно проследить до плотно упакованной решетки чашеобразных НДД-гексамеров в незрелых вирусных частицах, стабилизированных снизу взаимодействием SP1, усиленных межконтактными и внутригекмерными CTD-контактами [80,86]. После протеолиза соединения CTD-SP1 фуллереноподобная структура капсида собирается из гексамеров NTD, дополненных димеризацией CTD по кольцам NTD [5]. В зрелой частице расстояние между доменами CTD в каждом гексамере CA увеличивается и сопутствующие димерные контакты возможны только между двумя капсидами. Мы предполагаем, что эта реорганизация субъединиц СА является важной структурной детерминантой, которая облегчает больший доступ CTD к пептидному ингибитору в решетке зрелой частицы, тем самым повышая ее эффективность. К сожалению, в текущем разрешении реконструированных моделей CTD отсутствуют детали атома, необходимые для окончательного сравнения динамики и скрытой поверхности, вызванной механизмом сборки вирусных капсидов.

Эти пептиды показали потенциал в качестве противовирусных препаратов против нескольких лабораторно адаптированных и первичных изолятов ВИЧ-1, включая один устойчивый к RT-ингибитор и один устойчивый к PR-ингибитору штамм. NYAD-201 и NYAD-202 показали обнадеживающую активность широкого спектра, независимо от подтипа, использования корецептора и резистентности к лекарственным средствам изолятов. Однако NYAD-203 был цитотоксичным, как и NYAD-13 [59], аналогично приготовленным растворимым аналогом NYAD-1. Несмотря на то, что нам еще предстоит подтвердить механизм действия этих пептидов, мы продемонстрировали специфичность, используя пептид (NYAD-233), мутированный в двух критических аминокислотах (W184 и M185) на границе димера. Этот пептид с нарушением управляющего димера-интерфейса показал потерю активности в производстве вирусных частиц и анализе инфекционности.

В заключение, эти предварительные данные служат основой для разработки небольших стабильных альфа-спиральных пептидов и ингибиторов малых молекул, нацеленных на интерфейс димера CTD. Наблюдение, что относительно слабые связующие СА, такие как NYAD-201 и NYAD-202, достаточны для диссоциации и деформирования сердечников вирионов, предлагает поддержку для исследования гораздо более широкого класса противовирусных соединений, нацеленных на СА. Мы не можем исключить возможность того, что описанные здесь пептиды на основе CA могут вызывать дополнительные эффекты на репликацию вируса, не связанные напрямую с их способностью связывать CA-CTD. Например, наблюдение, что при некоторых обстоятельствах влияние NYAD-201 на инфекционную инфекцию может быть смягчено псевдотипированием VSV-G, предполагает, что этот пептид может также налагать дефект, связанный с вступлением; однако эти пептиды не препятствовали поглощению вирионов. Кроме того, существует прецедент, связанный с дефектами, связанными с СА, которые могут быть обратимы псевдотипированием VSV-G. Brun et al. [75] сообщили, что мутация в линкерном домене между CA-NTD и CA-CTD нарушает стабильность ядра. Это ключевое нарушение наложило дефект инфекционности, который был отменен в вирионах, несущих VSV-G, вместо ВИЧ-1 Env [75]. Аналогичным образом, было показано, что мутация в CA NTD (N74D) обошла необходимость переноса ядерного фактора переноса транспорта-SR2 в инфекцию ВИЧ-1 [87]; однако независимость transportin-SR2, предоставленная мутацией N74D, была Env-гликопротеином, зависящим от того, что вирус N74D с VSV-G-псевдотипированием мог инфицировать клетки, истощенные из транспорта-SR2, но вирус N74D с ВИЧ-1 Env не мог [88]. Эти наблюдения могут быть связаны с различиями в процессе развязывания, связанным с различными путями вирусной регистрации, опосредованными VSV-G и ВИЧ-1 Env. По аналогии, ингибирующие пептиды, представленные здесь, могут нарушить функцию пост-входа ЦА способом, обратимым посредством маршрута входа, связанного с VSV-G. Дальнейшие исследования потребуются для более полного понимания роли, которую СА играет в ранних событиях после вступления, и более точно определить стадию, на которой действуют ингибирующие пептиды, такие как действие NYAD-201.

AZT (Cat # 3485), T-20, [ингибитор слияния от Roche (Cat # 9845)], клетки MT-2 (доктор Д. Ричман), клетки Sup-T1 (д-р Джеймс Хокси), адаптированные к лабораторным исследованиям и первичные Штаммы ВИЧ-1, клетки U87-T4-CXCR4 были получены в рамках Программы исследований и справочной реактивов NIH по СПИДу. 293Т клетки были получены из Американской коллекции типовых культур. РВМС обрабатывали из крови, полученной из Нью-Йоркского центра крови.

pET14b или pET28a кодируют Gag-производные белки из штамма ВИЧ-1NL4-3. Полноразмерный вектор экспрессии gag был получен из NIH AIDS Research and Reference Reagent Program. ЦА-кодирующую область получали с помощью ПЦР-амплификации и вставляли в вектор pET28a. Фрагмент ДНК C-CA был предоставлен Drs Ming Luo и Peter E Prevelige Jr. Фрагмент ДНК C-CA субклонировали в вектор pET14b. Мутант C-CA (W184A / M185A) был получен из pET14b-C-CA путем перекрытия ПЦР. Соответствующие белки (включая меченые 15N или 15N / 13C мутантные C-CA и C-CA) экспрессировали и очищали, как описано ранее 10, 47, 53. Концентрации белка определяли с помощью молярных коэффициентов экстинкции A280 2,980 М-1 см-1 ( C-CA, мутант), 8,480 М-1 см-1 (C-CA), 33,460 М-1 см-1 (СА) и 64 400 М-1 см-1 (Gag) соответственно.

Для анализов метаболической радиоактивной метки клетки 293T (высевали на 2,5 × 105 клеток / лунку в 12-луночных чашках) трансфицировали молекулярным клоном ВИЧ-1 pNL4-3 [89], экспрессирующей конструкцией EIAV Gag pPRE-Gag [90,91 ], или экспрессирующий вектор HIV-1 Gag pCMVdeltaR8.2 / PR-. Этот клон был построен из pCMVdelR8.2 [92] путем введения PR-инактивирующей мутации из pNL4-3 / PR- [93]. Через 5 ч после трансфекции клетки обрабатывали указанными концентрациями NYAD-201 или контрольным пептидом NYAD-233 в течение 16-20 часов. Однажды после трансфекции клетки метаболически помечены в течение 2 ч (ВИЧ-1) или 5 ч (EIAV) с помощью 250 мкКи [35S] Met / Cys. Меченые вирионы осаждали в ультрацентрифуге, а лизаты клеток и вирусов подвергали иммунопреципитации и подвергали SDS-PAGE. Количественное определение проводили с помощью анализа Phosphorimager, а эффективность высвобождения вируса рассчитывали как количество вириона, связанного с Gag, в виде доли от общего количества (связанного с клетками-вирионами) Gag, синтезированного в период метаболической маркировки. Антисыворотка ВИЧ-1 иммуноглобулина (ВИЧ-Ig) была получена из Программы исследований и справочной реактивов NIH по СПИДу. Консервативную сыворотку EIAV любезно предоставил доктор Рональд Монтеларо (Университет Питтсбурга).

Пептиды синтезировали вручную твердофазным синтезом Fmoc, как описано ранее [59].

Спектры CD были получены на спектросколиметре Jasco J-715 (Jasco Inc, Япония) при 20 ° C с использованием стандартных параметров измерения в буфере Tris-HCl (20 мМ Tris, pH 8,0) в присутствии 1-15% (об. / Об. об.) ацетонитрила при конечной концентрации 125-500 мкМ. Во всех образцах конечные концентрации пептидов и соли всегда были одинаковыми, и спектры корректировались путем вычитания CD-спектров соответствующего эталонного растворителя.

Для исследования проникновения клеток клетки 293T высевали в 4-луночные камеры и инкубировали при 37 ° С с 5 мкМ конъюгированных с FITC пептидов в бессывороточной среде в течение 4 ч и / или дополнительных 16 ч в среде, содержащей сыворотку. После трех промывок с 1 × PBS живые клетки были исследованы и отображены под лазерным сканирующим конфокальным микроскопом Zeiss LSM510 (Zeiss).

Системы сборки in vitro были созданы, как описано [15,68,94,95] с незначительной модификацией. Мы использовали 50 мМ Na2HPO4, pH 8,0 в качестве диализного буфера. Буфер, используемый для сборки, также содержал 0,1 ~ 2 М NaCl. Для диализа пептидов использовали диализные трубки 500-Da-MWCO (Spectra / Por). Вкратце, белки сырья корректировали до соответствующей концентрации (25 мкМ для белков Gag или 50 мкМ для белков СА) с буфером Na2HPO4 при рН 8,0. После добавления 5% общей РНК E. coli (РНК: белок = 1:20 по массе), инкубации с различными дозами NYAD-201 и NYAD-233 в течение 30 мин при 4 ° С образцы диализовали в течение ночи в буфере Na2HPO4 при рН 8,0, содержащем 100 мМ NaCl при 4 ° С. Для сборки зрелых частиц CA добавление 5% общей РНК E. coli было опущено. Для проверки сборки использовалось отрицательное окрашивание. Медные сетки с углеродным покрытием (размер 200 меш, EM Sciences) обрабатывали 20 мкл поли-L-лизина (1 мг / мл, Sigma) в течение 2 мин. 20 мкл реакционного раствора помещали на сетку в течение 2 мин. Пятнистые сетки затем окрашивали 30 мкл раствора уранилацетата в течение 2 мин. Избыточное пятно удаляли, и сетки сушили на воздухе. Образцы исследовали с помощью электронного микроскопа TECNAI G2.

Влияние пептидов на димерную диссоциацию CTD дикого типа (wtCTD) было исследовано ITC (MicroCal VP-ITC) в соответствии с установленными протоколами [96,97]. Перед экспериментальными измерениями белки были полностью диализованы против 25 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,3). В типичном эксперименте инъекционный шприц ITC загружался белком 250 мкМ, растворенным в диализном буфере или смеси диализного буфера / пептида, а калориметрическая ячейка (приблизительно 1,4 мл активного объема) первоначально содержала только идентичную буферную смесь. Обычно титрования состояли из 28 инъекций 10 мкл, с уравновешиванием 240 у между инъекциями. Были получены термодинамические параметры и данные были проанализированы с использованием программного обеспечения MicroCal Origin 7.0 с использованием обновленной и исправленной (июнь 2008 г.) версии процедуры анализа диссоциации, подтвержденной по сравнению с методами раннего анализа [96,97].

Эксперименты по скорости седиментации проводились с использованием аналитической ультрацентрифуги ProteomeLab XL-A (Beckman Coulter) с 2-канальными центральными частями ротора An-60Ti при 42000 об / мин и 25 ° C. Радиальное сканирование на одной длине волны (обычно 280 нм) проводилось с интервалом 300 с. Плотность растворителя и вязкость и удельный объем белкового белка рассчитывали с использованием программы SEDNTERP. Образцы белка диализовали в буфер, содержащий 50 мМ натрий-фосфатный буфер (рН 7,3). Данные были приспособлены к непрерывным функциям распределения размера g (S) с использованием программы SEDFIT.

Эксперименты по равновесному осаждению проводили с использованием аналитической ультрацентрифуги ProteomeLab XL-A с использованием 6-канальных центральных частей ротора An-60Ti при 25 ° C. Образцы белка диализовали в 50 мМ натрий-фосфатный буфер (pH 7,3). Образцы центрифугировали в течение ~ 16 ч при 28000 об / мин, 32000 об / мин или 36000 об / мин, пока они не достигли равновесия, и никаких дальнейших изменений в распределении не наблюдалось. Радиальное сканирование измерялось при 280 нм. Данные были приспособлены к идеальной одновидовой модели, а также к быстрому равновесию мономеров-димеров с использованием программного обеспечения для анализа данных Beckman XL-A / XL-I (версия 6.03).

Стандартные 1H-13C HSQC-спектры были получены на 7 мкМ образце [U-13C, 15N] CTD в комплексе с NYAD-203 при различных концентрациях в пределах от 0 до 500 мкМ, полученных в 20 мМ фосфатном буфере (90% H2O / 10% D2O ) при pH 6,5. Концентрация белка была постоянной в каждом образце. Титрование проводили при 25 ° C путем получения данных на спектрометре AVANCE II 900 МГц, оборудованном TCI CryoProbe, с использованием 128 переходных процессов для усреднения сигнала. Данные ЯМР обрабатывали и анализировали в Topspin 2.1.

Экспрессирующие вирионы с зеленым флуоресцентным белком (GFP) получали путем котрансфекции клеток 293T (помещали в колбу T75) с провирусной ДНК pNL4-3 ВИЧ-1 (15 мкг) и экспрессирующего вектора (15 мкг), кодирующего гибрид GFP-Vpr белка. Через 48 ч вирус-содержащий супернатант сначала подвергали низкоскоростному центрифугированию для удаления клеток и мусора, а затем к ультрацентрифугированию при 20000 об / мин на роторе SW41 в течение 2 ч при 4 ° С для осаждения вирусных частиц. Вирусодержащую таблетку ресуспендировали в полной среде (0,5 мл) и хранили в аликвотах при -70 ° С. Двадцать тысяч клеток SupT1 инкубировали с ~ 0,3 мкг p24-нормированных вирусных частиц в отсутствие или в присутствии разных доз NYAD-201 и T-20 в течение 3 часов. После обработки 1 × Trypsin-EDTA (GIBCO) и одной промывки 1 × PBS клетки фиксировали и подвергали анализу FACS после очередной промывки 1 × PBS.

Одноцикличные анализы инфекционной активности проводились с использованием индикаторной клеточной линии TZM-bl (полученной от Джона Каппеса по программе NIAID AIDS Reagent Program), которая содержит интегрированные копии генов β-галактозидазы и люциферазы под контролем LTR ВИЧ-1 [73,98]. За один день до заражения клетки TZM-bl (4 × 104 клеток / лунку) высевали в 24-луночный планшет для культивирования тканей. RT-нормированные (200 000 RT cpm) запасы вируса использовались для инфицирования клеток TZM-bl. NYAD-201 добавляли к клеткам до или после заражения или присутствовали в течение 2-часового периода инфекции, как указано. Чтобы генерировать VSV-G-псевдотипированные вирусы, клетки 293T были подвергнуты трансфекции с помощью Env-дефектного производного pNL4-3 (pNL4-3 / KFS) [99] и вектора экспрессии VSV-G pHCMV-G [100]. Через 48 ч клетки промывали PBS и лизировали в буфере для лизиса люциферазы (Promega), а эффективность инфицирования определяли путем измерения активности люциферазы. Образцы анализировали субстратом анализа Promuga luciferase (Promega) в многофункциональном считывателе микропланшетов.

Для экспериментов, в которых клетки-продуценты обрабатывали NYAD-201 в течение 2 или 4 дней, клетки 293T трансфицировали pNL4-3. Через 5 ч после трансфекции клетки промывали и добавляли среду, содержащую указанные концентрации NYAD-201. Супернатант вируса собирали через 2 или 4 дня после трансфекции, и RT-нормированный вирус использовали для анализа инфекционности.

Эксперименты in vitro проводили следующим образом: клетки 293T в 60-миллиметровых чашках трансфицировали, как указано выше, и супернатант вируса собирали через 24 ч после трансфекции. Супернатанты вируса из нескольких 60-миллиметровых чашек объединяли и аликвотировали в несколько пробирок. NYAD-201 добавляли к супернатантам вируса в указанных концентрациях и инкубировали в течение приблизительно 20 ч при 37 ° С. Небольшую аликвоту вирусного супернатанта хранили для анализа инфекционности.

Ингибирующую активность NYAD-201 и других сшитых пептидов при репликации лабораторно адаптированными штаммами ВИЧ-1 определяли, как описано ранее [101], с незначительной модификацией. Короче говоря, клетки 1 × 104 МТ-2 были инфицированы ВИЧ-1 при 100 TCID50 (50% -ная инфекционная доза культуры ткани) (0,01MOI) в 200 мкл среды RPMI 1640, содержащей 10% FBS в присутствии или отсутствии пептидов при градуированном концентрации в течение ночи. Затем супернатанты культуры удаляли и добавляли свежие среды, содержащие свежеприготовленный тестовый пептид. На четвертый день после инфицирования 100 мкл культуральных супернатантов собирали из каждой лунки, смешивали с равным объемом 5% Triton X-100 и тестировали на антиген p24 с помощью ELISA.

Ингибирующую активность пептидов при репликации с помощью первичных изолятов ВИЧ-1 определяли, как описано ранее [102]. РВМС были выделены из крови здоровых доноров в Нью-Йоркском центре крови стандартным центрифугированием градиента плотности с использованием Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich). Клетки культивировали при 37 ° С в течение 2 часов. Неадгезивные клетки собирали и ресуспендировали при 5 × 106 клеток / мл среды RPMI-1640, содержащей 10% FBS, 5 мкг / мл PHA и 100 U / мл IL-2 (Sigma-Aldrich) с последующей инкубацией при 37 ° C в течение 3 дней. PHA-стимулированные клетки (5 × 104 клеток / мл) были инфицированы первичными изолятами ВИЧ-1 при 500 TCID50 (0,01 МОИ) в отсутствие или в присутствии ингибитора пептида при градуированных концентрациях. Культурные среды меняли каждые 3 дня и заменяли свежей средой, содержащей свежеприготовленный ингибитор. Супернатанты собирали через 7 дней после инфицирования и тестировали на антиген p24 с помощью ELISA. Процент ингибирования продукции p24, значений IC50 и IC90 рассчитывали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Software Inc.).

Цитотоксичность пептидов в клетках МТ-2 и РВМС измеряли с помощью гидрата XTT [(3 ‘- (1- (фениламино) -карбонил) -3,4-тетразолия-бис (4-метокси-6-нитро) безесульфоновой кислоты )], как описано ранее [102]. Вкратце, для клеток МТ-2 100 мкл пептида в градуированных концентрациях добавляли к равному объему клеток (1 × 105 клеток / мл) в 96-луночных планшетах с последующей инкубацией при 37 ° С в течение 4 дней, что приводило к параллельно анализу нейтрализации в МТ-2 (за исключением среды вместо вируса). В случае PBMC использовали 5 × 105 клеток / мл и измеряли цитотоксичность через 7 дней. После добавления XTT (PolySciences, Inc.) растворимый внутриклеточный формазан количественно определяли количественно при 450 нм через 4 часа со ссылкой при 620 нм. Процент цитотоксичности и значений CC50 рассчитывали, как указано выше.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующего интереса

HZ проводили in vitro и клеточные анализы, исследование проникновения клеток, круговой дихроизм, электронную микроскопию, изотермическую титровальную калориметрию и анализ равновесного осаждения и анализируемые данные; ФК провела антивирусные анализы и проанализировала данные; XZ помогал в подготовке и очистке белков; SB выполнила все исследования, связанные с ЯМР, проанализировала данные и письменную часть рукописи; AAW провела исследование по сборке и выпуску ВИЧ и EIAV, подготовила соответствующие цифры; AC, проанализировал данные МТЦ и письменную часть рукописи; DC, анализировали данные ЯМР и письменную часть рукописи; EOF проанализировал данные, написал и отредактировал рукопись, AKD задумал исследование, разработал все сшитые и другие пептиды, запланированные эксперименты, проанализировал данные, написал и отредактировал рукопись. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Рис-S1. Ячейка NYAD-233 и ее линейный аналог NYAD-209 в клетках 293T. Конфокальные микроскопические изображения клеток 293Т, инкубированные в течение 20 часов при 37 ° С с конъюгированными с FITC пептидами. Верхняя панель: изображение слева, контрастность контрастности (DIC) клеток с FITC-β-Ala-NYAD-209; Центр, флуоресцентное изображение FITC тех же клеток с FITC-β-Ala-NYAD-209; и Right, Overlay of DIC и флуоресцентные изображения FITC. Нижняя панель: слева, изображение DIC клеток с FITC-β-Ala-NYAD-233; Center, FITC флуоресцентное изображение тех же клеток с FITC-β-Ala-NYAD-233; и Right, Overlay of DIC и флуоресцентные изображения FITC. Всего в каждой обработке оценивали 200 клеток с помощью FITC-β-Ala-NYAD-209 или FITC-β-Ala-NYAD-233. Процент клеток в популяции, которые демонстрировали внутреннее окрашивание, показан в правом нижнем углу средней панели.

Нажмите здесь для файла

Рис-S2. Спектры HSQC 1H-13C CTD в комплексе с пептидом NYAD-203. Три панели отображают эффект титрования на выбранных кросспиках из алифатической области посредством титрования. Резонансы белка, которые могут быть однозначно назначены, аннотируются черным цветом, а из избыточного пептида — синим. (A) Населенные взвешенные изменения интенсивности поперечного пика Lys199 Cα в свободном и связанном состояниях при четырех концентрациях пептидов. (B) и (C) Влияние добавления пептида на перекрестный пик W184 Cα и Cδ1. (D) Стандартные одномерные протонные ЯМР-спектры NYAD-203 при различных концентрациях в 20 мМ фосфатном буфере при рН 7,0 и 288 K. Данные ЯМР обрабатывали и анализировали в Topspin 2.1.

Нажмите здесь для файла

Это исследование было поддержано NIH Grant RO1 AI081604 (AKD) и интрамуральным фондом из Нью-Йоркского центра крови (AKD). Исследования ЯМР поддерживались NIH GM-47021 и GM-66356 (DC), Фондом Кека и учреждениями-членами NYSBC. Эта работа была частично поддержана Программой внутрипрофильных исследований Центра исследований рака, Национального онкологического института, NIH. Мы благодарим Людмила Ангелова (конфокальная микроскопия), Елена Оксенов (электронная микроскопия) и доктор Ву Хэ (проточная цитометрия) за их техническую помощь. Мы благодарим К. Ваки за построение pCMVdeltaR8.2 / PR-клона и. J. Burns для предоставления вектора экспрессии VSV-G и R. Montelaro для анти-EIAV-сыворотки. ВИЧ-Ig был получен из Программы исследований и справочной реактивов NIH по СПИДу.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *