Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Генетическое разнообразие ВИЧ-1 в антенатальной когорте, Канада

HIV-1 Genetic Diversity in Antenatal Cohort, Canada
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3320510/

Non-B HIV-1 соответствовал месту происхождения пациентов.

Мы изучили генетическое разнообразие ВИЧ в когорте из 127 беременных женщин с ВИЧ-инфекцией, которые получали пренатальную помощь в госпитале Сент-Жюстин в Монреале, Канада, с 1999 по 2003 год. Назначения Клада были получены путем филогенетического анализа амплифицированных последовательностей pol. Генотипирование было успешным у 103 из 127 женщин, 59 (57,3%) из которых были инфицированы ВИЧ-1 класса кладин B и 44 (42,7%) с неклапатовыми вирусами B, включая подтипы A, C, D, F, G и H Четыре последовательности остались неназначенными. Сорок три из 44 женщин, инфицированных неклападными вирусами B, были новичками из стран Африки к югу от Сахары, а идентичность подтипа соответствовала тем, которые распространяются в их странах происхождения. Эти результаты подчеркивают эпидемиологическое значение ВИЧ-1, не связанного с ВИЧ, в антенатальных популяциях в крупном североамериканском городском центре, подчеркивают влияние перемещений населения на смешивание кладов и определяют группу пациентов, которые могут быть нацелены на наблюдение и последующую медикаментозную терапию ,

ВИЧ-1 обладает значительным генетическим разнообразием в результате высокой скорости мутации обратной транскриптазы, высокого вирусного оборота, вирусной геномной рекомбинации и иммунного и терапевтического отбора (1-3). Это разнообразие является проблемой для определения вирусной нагрузки, тестирования лекарственной устойчивости и разработки вакцины против СПИДа (1,4-6). Выявлены три филогенетические группы ВИЧ-1, основной (M), outlier (O), non-M, non-O (N) (2,7). Большинство инфекций ВИЧ-1 вызваны вирусами группы М, которые содержат 9 кладов (A-D, F-H, J и K) и> 13 интербисутипных рекомбинантов, известных как циркулирующие рекомбинантные формы (CRF) (8). Clade B наиболее распространен в Северной Америке, Европе и Австралии. Однако в последнее десятилетие распространенность заражения вирусами nonclade B увеличилась во Франции, Бельгии, Испании и Швейцарии (9-12), в значительной степени после миграции из или в международные поездки в районы, связанные с ВИЧ (13). Неклапатные вирусы B также распространяются на Кубе (14) и в Соединенных Штатах (15,16). Мы измерили разнообразие подтипов ВИЧ-1 в многоэтнической когорте беременных ВИЧ-инфицированных женщин, чтобы определить, появляется ли в Канаде после заражения популяция non-class B HIV-1 и подходят ли антенатальные когорты подходящим сторожевым сайтам для наблюдения за введением неклапанных вирусов B в Канаду.

В исследование были включены сто двадцать семь ВИЧ-инфицированных женщин, получающих дородовую помощь в Центре Матернел и Инфантиль-су-СИДА, Госпиталь Сент-Жюстин, Монреаль, с октября 1999 года по сентябрь 2003 года. Критерии включения: 1) возраст ≥18 лет, 2) запрос на дородовую помощь, 3) положительные результаты серологического лечения ВИЧ-1 и 4) информированное согласие. Стандартизированное клиническое наблюдение, включая антиретровирусную (АРВ) профилактику и лечение, было предоставлено всем женщинам и их детям. Это когортное исследование проводилось в соответствии с руководящими принципами Совета по обзору этики больницы Сент-Жюстин.

Серологический статус ВИЧ-1 определяли с использованием метода AxSYM HIV 1/2 gO (Abbott Diagnostics, Висбаден, Германия) и подтверждали вестерн-блоттингом. Вирусную нагрузку ВИЧ-1 измеряли с использованием теста Versant HIV-1 RNA 3.0 (bDNA, Bayer, Pittsburgh, PA, USA). Количество CD4 + Т-клеток измеряли с помощью проточной цитометрии. Стандартизованный сбор данных оценивал социально-демографические переменные и предыдущее и текущее лечение АРВ-терапией. Числовые переменные сравнивались с использованием теста Крускала-Уоллиса. Категориальные переменные изучались с использованием точного теста Фишера (SPSS версии 11.0, SPSS, Inc., Чикаго, Иллинойс, США).

В случаях, когда вирусная нагрузка составляла> 1000 копий РНК / мл плазмы, генотипирование ВИЧ-1 выполняли по протоколу (Virco BVBA, Mechelen, Belgium) на основе секвенирования фрагмента с длиной 1 497 п.н. гена pol-HIV-1 ( позиция 2253-3749). В случаях, когда вирусная нагрузка составляла менее 1000 копий / мл, вирусная РНК экстрагировалась из плазмы, а сегмент поля 524 п.о. (положение 2597-3120) амплифицировали с использованием праймеров 3069R (5′-GGA TGG CCC AAA GGT TAA ACA -3′) и 3591F (5′-ATC CTA CAT ACA AAT CAT CCA T-3′) и метод 1-ступенчатой ​​обратной транскрипционно-полимеразной цепной реакции QIAamp (RT-PCR) (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada). Условия ПЦР составляли 40 циклов, состоящих из 94 ° С в течение 30 с, 53 ° С в течение 1 мин и 72 ° С в течение 1 мин с последующим растяжением при 72 ° С в течение 10 мин. Ампликон были клонированы в pPCR-Script (Stratagene, La Jolla, CA, USA) и секвенированы с использованием химии терминатора красителей (Beckman-Coulter, Palo Alto, CA, USA).

Последовательности были сопоставлены со ссылками (2001), представляющими разные подтипы ВИЧ-1 (http://hiv-web.lanl.gov) (8), используя Clustal X version 1.81 (17). Были собраны двухпараметрические матрицы Кимуры (коэффициент перехода / трансверсии 2) (18,19). Филогенетические реконструкции были построены по методу соседа, и для оценки топологии дерева (версия MEGA 2.1) (20) были выполнены 1000 бутстраповских повторных заимствований. Оценка клад была основана на надежной группировке (> 80% бутстрапа) с опорными последовательностями (8). RIP версия 1.9 (http://www.hiv.lanl.gov/content/hiv-db/RIPPER/rip_test.html) (21) использовалась для изучения потенциальных рекомбинантов интерсубъектов с разрывом зазора, размером окна 200 символов , а порог значимости — 90%.

В исследование были включены сто двадцать семь женщин в возрасте 18,3-42,6 лет (медиана 30,9, межквартильный интервал [IQR] 7.2): 40 (31,5%) из Северной и Центральной Америки, 35 (27,6%) из Карибского бассейна, 1 (0,8%) из Азии и 51 (40,2%) из стран Африки к югу от Сахары. Медиана вирусной нагрузки ВИЧ-1 во время включения в исследование составляла 3,24 log РНК-копии / мл плазмы (IQR 1,97), а средний показатель количества CD4 + составлял 403 клетки / мкл (IQR 248). Из 127 пациентов 66 (52,0%) не получали АРВ-терапию до включения в исследование, 8 (6,3%) прервали терапию и 53 (41,7%) получали режим, состоящий из 1 (n = 2), 2 ( n = 9), 3 (n = 39) или 4 (n = 3) АРВ-препаратов.

Ген pol-HIV-1 был успешно амплифицирован и секвенирован у 103 (81,1%) из 127 пациентов, что сопоставимо с результатами других исследований (22). Семьдесят три результата были получены с помощью процедуры Virco и 30 были получены с использованием альтернативного метода RT-PCR. Неудовлетворительная амплификация была связана с низкой вирусной нагрузкой: у пациентов с уровнем виремии <500 копий / мл приходилось 23 (95,8%) из 24 человек, у которых усиление гена было безуспешным по сравнению с 27 (26,2%) из 103 в остальной части исследовательская группа (p <0,0004, точное испытание Фишера). Это согласуется с выводами о том, что больная доля пациентов с неудачной амплификацией гена была обработана АРВ-терапией во время включения в исследование (75,0% против 34,0%, р <0,0004, точный тест Фишера). Несмотря на это ограничение, информация о последовательности была получена у более чем половины пациентов с уровнем виремии <500 копий / мл (27/50), а у одной трети пациентов с уровнем виремии <50 копий / мл (8/24 ).

Для идентификации клана ВИЧ-1 использовали филогенетический анализ, основанный на фрагменте pol 524-bp (позиция 2597-3120). Во всех случаях группировка на основе фрагмента 524-bp соответствовала той, которая была получена, когда все доступные 1 497-bp-последовательности анализировались отдельно (данные не показаны). В совокупном анализе последовательности, полученные из 59 (57,3%) из 103 пациентов, сформировали четко определенный кластер с опорными последовательностями кладин B (рисунок, левая панель и данные не показаны). Из этих 59 пациентов 27 (45,8%) были канадского происхождения, 27 (45,8%) были из Гаити, 2 (3,4%) из Мексики, 1 (1,7%) из Ямайки, 1 (1,7%) из Доминиканской Республики, и 1 (1,7%) из Соединенных Штатов. Филогенетическое перекрытие между этими последовательностями было значительным, а поддержка бутстрапов для кластеризации на основе страны происхождения составляла <50% (рисунок, левая панель).

Филогенетический анализ последовательностей pol, полученных от беременных женщин, инфицированных ВИЧ-1. Деревья были сконструированы с использованием метода соседнего соединения, как описано у пациентов и методов. Соотношение перехода / трансверсии 2 было использовано и было выполнено 1000 повторных попыток загрузки. Левая панель: Подгруппировка с кладом B HIV-1. Правая панель: группировка с не-ВИЧ-инфекцией. Справочные последовательности (REF) были получены из базы данных Национальной лаборатории Лос-Аламоса (2001) (8). Шкала шкалы представляет собой 0,02 нуклеотидных замены на сайт. Буквенные коды указывают страну происхождения. Вся информация о нуклеотидной последовательности была отправлена ​​в GenBank (№ присоединения DQ059647-DQ059749). CRF, циркулирующая рекомбинантная форма.

Кроме того, 44 (42,7%) из 103 пациентов были инфицированы неклапатовыми вирусами B. Девять (20,5%) амплифицированных последовательностей были похожи на контрольные последовательности из клады A, включая CRF01-AE. Внутри этого кластера независимая группировка последовательностей, полученных от пациентов TV641, TV731 и TV783, поддерживалась только низкими значениями начальной загрузки (рисунок, правая панель). Последовательности 12 пациентов (27,3%) сгруппированы вместе с ссылками на клад С (93% бутстрап), а TV833 — дистальным таксоном. Пять (11,4%) сгруппированы с кладой D. Два (4.55%) сгруппированы с кланами F1 и F2, причем TV633 ближе всего к ссылке CRF05-DF. Одна последовательность (2,27%) сгруппирована с кладером H (99% бутстрап) и 11 (25,0%) с кладом G. Среди них 8 последовательностей образовали хорошо подкрепленный подкластер CRF02-AG (97% бутстрап), тогда как TV909 сгруппированы ближе всего к кладу G-ссылке (96% бутстрап). TV737 и TV695 образовали отдельный подкластер G clade (100% бутстрап) (рисунок, правая панель). 938-нуклеотидные (nt) фрагменты области V1-V3 оболочки (env) гена амплифицировали, секвенировали и анализировали в образцах пациентов TV737 и TV695. Эти сегменты сгруппированы близко друг к другу (96% бутстрап), но свободно с ссылками на клад G (41% бутстрап), которые подтвердили, что эти 2 изолята выпадают за пределы группы подтипов G (данные не показаны). Наконец, TV721 и TV749 свободно кластеризовались с J-ссылкой (61% бутстрап), в то время как TV725 и TV919 группировались вне основных кладов, хотя все они относились к группе M (100% бутстрап), как определено филогенетическим анализом с использованием групп N, O, U , и SIVcpz (8) (не показаны).

У пациентов, у которых имелись последовательности в 4997 нт, потенциальная межзубчатая мозаичная природа вирусов с неопределенным назначением кладов была исследована с использованием RIP (21). Этот анализ показал, что TV731 и TV783 имели значительную гомологию с консенсусом A1 + A2, TV833 был гомологичен эталонной ссылке Cade, а TV737 и TV909 были очень похожи на консенсус Clade G (> доверие 90%), что подтвердило первоначальные оценки. Рекомбинантный характер TV633 также поддерживался со значительной гомологией с кланами D и F (предполагаемый кроссовер в положении 2795-2796), в то время как TV695 показал наибольшее сходство с кладом G в его 5′-концевой части и кладу C на 3′-конце (> 90% -ная уверенность), с потенциальной точкой останова в позиции 3169-3170. Кроме того, TV721, TV725, TV749 и TV919 не показали значимой гомологии с какой-либо из последовательностей в эталонном выравнивании, что предотвращало оценку их предполагаемого межсубъектного характера и их присвоение существующим кланам М-групп (рисунок, правая панель и данные не показано). TV721 и TV749 сравнивались с последовательностями ВИЧ в GenBank с использованием BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Ближайшей гомологией с TV721 было выделение A2-225.692 из Уганды (23), с 92% идентичностью в сегменте 522-nt. Ближайшей гомологией к TV749 была выделена 97CM.MP806 из Камеруна (24), с 89% идентичностью в сегменте 884-nt. Когда 938-nt сегментов области V1-V3 env амплифицировали и секвенировали, TV721 и TV749 группировались близко друг к другу (100% -ный бутстрап) и с ссылками на клад G и J (92% -ный бутстрап) (данные не показаны). Этот вывод показывает, что TV721 и TV749 представляют собой сложные сложные мозаичные рекомбинанты или новый подтип группы ВИЧ-1 М.

У всех, кроме 1 пациента (43 [97,7%] из 44), инфицированных неклапатовыми вирусами B были новоприбывшие из Африки, в том числе 34 (77,3%) лица, ищущие убежища. Девять пациентов родились из Западной Африки: Кот-д’Ивуара (n = 4), Буркина-Фасо (n = 1), Гвинеи (n = 2), Ганы (n = 1) и Нигерии (n = 1). Двадцать пять происходили из Центральной Африки: Конго (n = 7), Демократическая Республика Конго (n = 3), Руанда (n = 7), Бурунди (n = 4), Камерун (n = 3) и Чад (n = 1). Четыре из них происходили из Восточной Африки: Эфиопия (n = 3) и Эритрея (n = 1). Четыре из них произошли из южной части Африки: Зимбабве (n = 3) и Мадагаскар (n = 1). Один пациент отказался указать страну происхождения. Географическая кластеризация наблюдалась на кладограмме, причем группировки из Западной Африки группировались между группами кладов G и Восточной и Южной Африки, группируя их с кладой C. Наибольшее генетическое разнообразие ВИЧ-1 наблюдалось у пациентов из центральной Африки (рис., Правая панель), так как ранее сообщалось (25).

Медиана вирусной нагрузки и количества лимфоцитов CD4 + во время включения в исследование не были существенно различны у пациентов, инфицированных вирусом clade B, по сравнению с инфицированными вирусом nonclade B, хотя больше пациентов, инфицированных вирусом clade B, получали АРВ-терапию. У пациентов, не получавших лечение, средний показатель количества CD4 + клеток был на 91 клетку / мкл ниже у тех, кто инфицирован неклапатным вирусом B, что указывает на более прогрессирующее заболевание (таблица). Сравнение продолжительности заражения между подгруппами было невозможно.

* Вирусная нагрузка ВИЧ-1 и количество лимфоцитов CD4 + были измерены, как описано у пациентов и методов. Значение различий между группами было проверено с помощью теста Крускала-Уоллиса или точного теста Фишера. Анализ проводился по всей исследовательской группе (N = 103) или был ограничен теми, кто не получал лечение (n = 61). IQR, межквартильный диапазон; АРВ-терапия, антиретровирусная терапия. † Тест Крускала-Уоллиса. ‡ Точный тест Фишера. §Статистически значимый (р <0,05) путем направленного теста.

Разнообразие кладов ВИЧ-1 характеризовалось среди когорт ВИЧ-инфицированных женщин, получающих дородовую помощь в больнице третичной помощи, обслуживающей космополитическое население. Результаты показывают, что у 59 (57,3%) из 103 пациентов, у которых генотипирование было успешным, были инфицированы ВИЧ-1 класса clade. Этот вывод совместим с широким распространением клады B в Северной и Центральной Америке и Карибском бассейне, из которых 40 (31,5%) и 35 (27,6%) соответственно из 127 пациентов в нашей когорте возникли, а относительно высокая распространенность инфекции ВИЧ-1 среди пациентов из Гаити в районе Монреаля (1,26). Кроме того, 42,7% пациентов, у которых генотипирование были успешными, были инфицированы некладеобразными В-вирусами, что намного больше, чем показатель, зарегистрированный у 312 ВИЧ-инфицированных доноров крови США (2%) (16) и в недавнем отчете о состоянии общественного здравоохранения Канады (8,9%) (27). Насколько нам известно, это самая высокая распространенность ВИЧ-инфекции, не связанной с ВИЧ, в любой североамериканской исследовательской группе, включая военнослужащих США (16,28,29). Были идентифицированы последовательности, относящиеся к каждой группе группы ВИЧ-1 М, за исключением J и K. Этот уровень генетического разнообразия ранее не сообщался в североамериканской исследовательской группе, за исключением реестров эпиднадзора за центрами по контролю заболеваний и профилактике заболеваний ( 22) и столь же обширна, как и на Кубе (14). Четыре из сегментов pol получили неоднозначную кластеризацию среди эталонных последовательностей, что свидетельствует о том, что они представляют либо новые кланы группы HIV-1 M, либо комплексные рекомбинанты. Однако для решения этой проблемы потребуется дополнительная характеристика, включая последовательность полного генома. Исходя из наших результатов, заражение несколькими подтипами ВИЧ-1 нельзя надежно оценить.

В африканских женщинах было обнаружено 97,7% некладовых B-вирусов, и во всех случаях идентичность кладов соответствовала вариантам, циркулирующим в области происхождения пациента (1). Не было обнаружено существенной разницы между пропорциями африканских женщин у пациентов с неудачной амплификацией (8 [33,3%] из 24) по сравнению с теми, у кого усиление было успешным (43 [41,7%] из 103, p = 0,496, точное испытание Фишера) что указывает на отсутствие смещения выбора. Недавние вооруженные конфликты на африканском субконтиненте привели к притоку в Канаду новичков из эндемичных по ВИЧ районов (30,31). Среди нашей исследовательской группы даты прибытия в Канаду пациентов, инфицированных nonclade B HIV-1, соответствуют миграции беженцев после геноцида в Руанде и гражданской войне в бывшей Республике Заир и соседнем Конго (данные не показаны) (30, 31). В Европе и на Кубе распространены вирусы Nonclade B в результате международных поездок и иммиграции из Африки (9-14 лет). Наше исследование демонстрирует, что при сходных обстоятельствах в большом, североамериканском городском центре вводятся несколько кланов ВИЧ-1. С точки зрения общественного здравоохранения антенатальные когорты могут представлять собой важный сторожевой сайт для мониторинга притока новых вариантов ВИЧ-1 в промышленно развитых странах.

Предлагаемая цитата для этой статьи: LAkouamba BS, Viel J, Charest H, Merindol N, Samson J, Lapointe N, et al. Генетическое разнообразие ВИЧ-1 в антенатальной когорте, Канада. Emerg Infect Dis [серийный номер в Интернете]. 2005 Авг [дата указана]. http://dx.doi.org/10.3201/eid1108.040877

Мы благодарим Кэти Дерой, Сильви Валуа и Мартину Кати за экспертную техническую помощь, Ампху Хэмми за статистический анализ, и Лорана Кнафо за автоматизацию секвенирования ДНК.

Эта работа была частично поддержана Детским фондом СПИДа Элизабет Глейзер (грант № 28-PG-51355), а также Рисами SIDA-Maladies Infectieuses Фонда де-ла-Речерче и Санте-дю-Квебек (FRSQ). HS — младший научный сотрудник FRSQ. BSA является получателем стипендии от правительства Габона.

В настоящее время г-жа Акуамба проводит аспирантуру в Отделе микробиологии и иммунологии, факультет медицины, Университет Монреаля. Ее исследовательские интересы сосредоточены на изучении иммунных реакций на ВИЧ у матери во время беременности.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *